mＲNA 是一种极具潜力的新型治疗产品，随着技术的发展，mＲNA 已被越来越广泛应用于免疫学、肿瘤学、疫苗和先天性代谢疾病等领域的临床研究。近期，由于新型冠状病毒肺炎疫情暴发，mＲNA 疫苗的研发及上市化进程被大大提速，预示在不久的将来可能有更多的mＲNA 产品进入市场。为了适应mＲNA药物产业未来发展的需求，本文对该种产品的特点及产业化现状进行了研究，对其生产的关注点进行了思考，期望能为在我国开展mＲNA 药物的开发提供一定参考。

1 mＲNA 药物介绍

利用mＲNA 作为核酸药物的概念早在20 年前就已出现。1990 年，Wolff 等［1］通过在小鼠肌肉组织中注射体外转录mＲNA( IVT mＲNA) 及质粒DNA的方式实现了目标蛋白在小鼠体内的表达。

mＲNA 于1961 年被首次发现［2］，在随后10 年间，科学家们对其开展了大量结构、功能以及代谢方面的研究。20 世纪90 年代，科学家们开展了一系列关于IVT mＲNA 的临床前研究［3－6］，以进一步探索其在疾病治疗领域的应用。但由于当时科学技术水平的限制，有关mＲNA 稳定性及递送方面的问题一直没有获得突破，人们转而将目光投向了对质粒及病毒DNA 载体的研究。

与其他核酸类治疗产品相比，IVT mＲNA 具有诸多不同之处。质粒DNA 必须先进入细胞核，经转录成mＲNA，离开细胞核后在细胞质内被翻译成蛋白后，发挥其后续功能。而IVT mＲNA 进入到细胞质内便能被即刻表达成蛋白，无需进入细胞核内就能发挥作用。此外，与质粒DNA 及病毒DNA 不同的是，IVT mＲNA 只是瞬时表达，可以通过体内生理代谢被完全降解，IVT mＲNA 不会整合到细胞基因组，即不会带来插入突变的风险。

与其他生物制品相比，IVT mＲNA 在生产上具有成本低、流程简单、灵活及通用性的特点，近年来吸引了很多投资者的目光。2015 年以来，Moderna therapeutics 公司、BioNtech 公司和CureVac 公司等3家具有代表性的mＲNA 治疗药物研发公司吸引了28 亿美元的私人投资。其中，Moderna 公司在2018年的估值约为76 亿美元，创下了生物科技IPO 规模最大的纪录［7］。目前，一些制药企业巨头如诺华公司、赛诺菲巴斯德公司及阿斯利康公司等都已竞相投入到了mＲNA 产品的投资及开发中［8－9］。在某些病毒疫苗及肿瘤疫苗领域，IVT mＲNA 已经进入或完成了Ⅲ期临床研究，但在心血管、内分泌及其他疾病治疗领域尚处于临床前阶段［10］。

近年来，随着核酸合成、修饰和递送技术的发展，mＲNA 再次成为基础研究及临床应用领域的热点［11－12］。2017 年，基于肿瘤新生抗原的mＲNA 肿瘤疫苗在临床上展现出非常好的疗效而获得广泛关注［13］。2020 年，由于在临床上展现出优异的有效性，COVID-19 mＲNA 疫苗在众多候选药物中脱颖而出，使行业再一次感受到了这种新技术路径的强大潜力。由此可预期，伴随着技术发展以及资本的涌入，mＲNA 药物将在未来迎来新一轮研发热潮和产业发展。

1.1 mＲNA 药物的结构及设计

IVT mＲNA 的结构与内源性mＲNA 非常相似，主要包括5'端帽子( cap，简称帽子) 、5'端非翻译区( untranslated region，UTＲ) 、开放阅读框( open readingframe，OＲF) 、3'端非翻译区和多聚腺苷酸尾巴［Poly( A) ］等结构。

1.1.1 帽子

成熟的真核生物mＲNA 的5'端都有1个甲基鸟苷帽( m7G) 结构。加帽能够帮助mＲNA被顺利转运出细胞核，增加mＲNA 稳定性，防止其被核糖核酸酶降解，对蛋白的表达至关重要。目前主要有2 种加帽方式［14］: 一种采用两步法，即在mＲNA 转录反应后，使用加帽酶加帽，采用这种方式合成后的产物与内源性mＲNA 一致; 另一种为一步法，即在转录反应中加入合成的帽类似物，但是这种方法的局限性在于帽类似物会与三磷酸鸟苷( GTP)发生竞争反应，导致部分mＲNA 加帽失败从而无法被有效翻译。此外，帽类似物对于蛋白翻译及稳定性的影响还与细胞类型及细胞所处分化状态相关。研究发现包含1 个或多个硫代磷酸基团的帽类似物具有抗脱帽酶( DCP2) 的作用，从而可以大大延长mＲNA 在体内的半衰期［15］，但小鼠体内试验发现，经硫代磷酸基团修饰的mＲNA 所翻译出来的蛋白具有较强的免疫原性［16］。使用帽类似物还可能产生反向加帽的情况，使其产物无法被核糖体识别。为此，科学家们开发出一种抗反向加帽的类似物( anti-reverse cap analog，AＲCAs) ，大大提高了蛋白翻译效率［17］。2018 年，斯坦福大学研究团队与TrilinkBioTechnologies 公司联合开发了称为“CleanCap”的共转录加帽法，通过利用腺苷酸鸟苷酸( AG) 三聚体模拟天然5'的Cap1 即m7G 结构，将加帽效率提高到接近90%～99%［18］。

1.1.2 多聚腺苷酸尾poly( A) 

poly( A) 结合蛋白( PABP) 可通过翻译起始因子( 如elF4G 和elF4E)与5'帽连接形成闭环结构，协同参与对mＲNA 的稳定性及翻译活性的调节。不同长度的poly( A) 序列可以不同程度地影响mＲNA 的翻译效率。一般来说，poly( A) 尾的长度在120 ～ 150 个核苷酸范围内。poly( A) 尾可以通过模板直接转录法( 一步法) 或是在转录后增加重组多聚腺苷酸聚合酶法( 二步法)获得。使用二步法可以使用能避免会被特异性腺苷酸核酸酶降解的经特殊修饰的核苷酸，但该方法的局限性在于其所导致的产物poly( A) 尾的长度各异，无法很好满足临床应用的需求。

1.1.3 5'及3'端非翻译区( 5' and 3' UTＲs) 

在mＲNA 分子上添加5'及3'端非翻译调控区是优化IVT mＲNA 的表达效率及稳定性的另一种策略。比如，Kozak 等［19］在5'UTＲ 区域插入序列GCC-( A/G) -CCAUGG 可以提高翻译的准确性。在3'端加入α及β 球蛋白的UTＲ 能提高mＲNA 的稳定性［20］。在3'端采用真核翻译延伸因子1A1( eEF1A1) 的UT及在5'端采用正痘病毒mＲNA 的UTＲ 能抑制3'-5'外切酶的降解及5'端脱帽作用。对于那些需要尽快在体内被代谢的蛋白，还可以通过在3'UTＲ 引入富含腺苷酸尿嘧啶( AU) 的序列，从而确保蛋白被快速降解和短时间表达［21］。

1.1.4 编码区域

密码子及其前后序列能够直接影响翻译的效率。使用常用密码子代替稀有密码子可大大提高蛋白翻译效率。然而，以常用密码子替代稀有密码子导致的快速翻译可能引起某些蛋白被错误折叠。对于某些IVT mＲNA 疫苗来说，使用常用密码子代替稀有密码子可能导致核糖体将CUG识别为翻译起始点或发生核糖体移码翻译［22］，要避免密码子优化造成的上述影响。

1.2 mＲNA 药物的递送系统及相关设计

药物递送一直是mＲNA 药物发展所面临的较大的技术障碍。大多数真核细胞能够通过胞吞作用主动将裸露的mＲNA 摄入胞体内，但其效率极低，10 000 个分子中通常仅有1 个能够通过细胞膜。mＲNA 进入体内后，首先面临周围组织液或血液中核酸酶的降解，此外还需要通过负电性的磷脂双分子生物膜。因此，其制剂系统需要保护mＲNA 不被核酸酶降解，同时还需要促进其被细胞摄取。

截至目前，对于mＲNA 药物的递送系统已经经历了3 代技术演变。从20 世纪90 年代出现的以鱼精蛋白、阳离子高分子PEI、阳离子脂质体为代表的第1 代递送系统，到90 年代末出现的以可降解、可离子化高分子为代表的第2 代递送系统，再到近些年出现的以可离子化脂质纳米粒为代表的第3 代递送系统。递送技术的进步极大地促进了mＲNA 制药产业的发展和临床应用。

作为目前全球mＲNA 制药领域的三大巨头，Moderna 公司、BioNTech 公司及CureVac 公司分别采取了不同的递送策略。其中，Moderna 公司采用的是可以较好维持ＲNA 稳定性的纳米颗粒脂质体( lipid nanoparticles，LNPs) 递送技术［23］; BioNTech公司采用的是阳离子脂质体递送技术Lipoplexes( LPX) 及LNP 递送技术［24］; CureVac 公司最初使用的是鱼精蛋白制剂技术，但由于鱼精蛋白和mＲNA的结合太紧密，使得蛋白表达效率受限，因此在后来转而投向了LNP 技术。

LNPs 目前代表着最先进的ＲNA 输送技术，开发该技术的先驱有Acuitas 公司、Arbutus 公司及Arcturus 公司等为代表的企业及以麻省理工学院( MIT) 为代表的研究机构［25］。LNPs 制剂通常是将叔胺或季胺盐型可电离阳离子脂质体与助类脂［如二油酰磷脂酰乙醇胺( DOPE) 、胆固醇及聚乙二醇( PEG) ］等按照一定比例混合而成，具有安全性高、合成工艺简单、无免疫原性、体内易降解等优点［26］。其中，阳离子脂质体用以包裹电负性mＲNA，胆固醇用以稳定脂质双分子层，PEG 为纳米颗粒提供水合层，以提高胶态稳定性，减少蛋白吸附。LNP 递送ＲNA 的原理目前还不完全清楚，但通常认为，LNP通过非共价亲和力和细胞膜结合并通过由网格蛋白clatherin 介导的机制内吞入细胞，mＲNA 逃离内吞小泡，被释放到细胞质中表达目标蛋白，然而LNP还可以通过相反的胞吐作用被排出细胞外，可能降低药物的递送效率。

2 mＲNA 药物全球管理情况

目前，除了将用作预防及治疗用的mＲNA 药物明确定义为疫苗类生物制品外，美国及欧盟等药品管理机构并未就mＲNA 属于哪类药物做明确定义，也未发布任何相关的指南或指导文件。不过，普遍还是倾向于将其纳入生物制品、细胞治疗产品或体细胞治疗产品的范畴进行管理。由于大多数IVTmＲNA 的临床试验是在欧洲发起的，因此即使是全球药品管理最先进的美国FDA，目前对其的管理经验也非常有限。

在美国，根据1998 年FDA 发布的《人体细胞及基因疗法指导原则》所提供的定义，基因疗法是指改变细胞遗传物质为基础的医学治疗，鉴于mＲNA并不会引发细胞基因层面的改变，因此在美国不太可能将其纳入基因疗法的范畴中进行管理。

欧洲EMA 将基因治疗产品、细胞治疗产品和组织工程产品统一定义为前沿医疗产品( advancedtherapy medicinal products，ATMPs) 。根据欧盟2009年颁布的关于《前沿医疗产品修订指令》( Directive2009 /120 /EC) 中的定义，基因治疗产品属于生物制品，是指可以用以调节、修复、替换、增加或删除基因序列的包含或者是由重组核苷酸组成的活性物质，其作用与其组成序列及所表达的产物直接相关。因此，mＲNA 在欧盟很有可能被纳入前沿医疗产品下的基因治疗产品的范畴中进行管理。但根据此项指令，如果mＲNA 是用于预防传染疾病的疫苗或是由化学合成方式进行生产则都不属于基因治疗产品的类别［27］。

在我国，按照《中华人民共和国药典》2020 版《人用基因治疗制品总论》中的定义，“人用基因治疗制品通常由含有工程化基因构建体的载体或递送系统组成，其活性成分可为DNA、ＲNA、基因改造的病毒、细菌或细胞，通过将外源基因导入靶细胞或组织，替代、补偿、阻断、修正特定基因，以达到治疗疾病的目的”，因此mＲNA 类药物在我国应属于基因治疗产品的范畴。

2020 年，国家药品监督管理局药品审评中心以生物制品为分类受理并审评了多个新型冠状病毒肺炎( COVID-19，简称新冠肺炎) mＲNA 疫苗品种的临床试验申请，根据新冠肺炎疫情防控应急工作需要，基于对该类产品的科学认知，提出了对于此类品种临床前药学及非临床评价的考虑［28－29］。同时起草了《新型冠状病毒预防用mＲNA 疫苗药学研究技术指导原则( 试行) 》［30］，用于指导应急状态下mＲNA疫苗的研制。可以说，这是全球范围内第一份专门针对mＲNA 疫苗的指导原则，体现出我国在前沿技术产品领域对标国际先进水平所做的不懈努力。

目前，在大多数国家及我国都已形成了关于基因治疗产品的指南和指导文件，这可以为未来mＲNA 的开发提供非常有价值的参考，但与DNA 以及病毒载体不同的是，mＲNA 的表达呈剂量依赖性和瞬时性，mＲNA 并不会整合入宿主细胞基因组内，除非编码蛋白为DNA 修饰酶，否则不会导致宿主细胞的基因改变。因此，在基因治疗产品指南中明确提出的针对基因修饰、种系遗传、遗传毒性或致癌性等方面的检测项目可能并不适用于mＲNA 产品。未来各国机构应基于该产品的特性，结合其特定的风险，才能制定出更为有效、更为适用的技术指南和管理方式。

2.1 全球已上市mＲNA 药物

2020 年，随着新冠肺炎疫情在全球范围内暴发，各国竞相开展了对于COVID-19 疫苗的研发及生产工作。mＲNA 疫苗由于在初期临床试验中就已展现出较好的安全性及有效性，因而在众多候选药物中脱颖而出。与传统疫苗直接引入抗原蛋白刺激宿主免疫应答不同，mＲNA 疫苗引入编码疾病特异性抗原的mＲNA，利用宿主细胞产生抗原，从而触发免疫应答［31］。2020 年12 月，经美国疫苗和相关生物产品咨询委员会( Vaccines and Ｒelated Biological Products Advisory Committee，VＲBPAC) 线上会议讨论决定，批准授予由辉瑞公司与德国生物新技术公司( BioNTech) 联合开发的BNT162b2 及由美国生物科技公司( Moderna) 研发的mＲNA-1273 共2 款mＲNA 疫苗产品在国内的紧急使用权，将其安全性及有效性在更广泛人群中进行验证。

FDA 发布的相关报告显示，2 项产品的有效率均达到90%以上，不过注射mＲNA 疫苗可能出现恶心、呕吐、面部肿胀、疲劳、头痛和肌肉疼痛等不良反应，有学者推测其组成结构可能与其不良反应有一定的关联，许多不良反应可能是源自用于mＲNA递送的脂质物质。由于目前所描述的不良反应与许多其他疫苗的不良反应非常相似，严重的不良反应还是相当罕见，因此mＲNA 疫苗仍是安全有效的［32］。

2.2 mＲNA 药物的生产及主要关注点

目前为止，由于使用化学合成法仅能合成开放阅读框在150 个核苷酸左右的mＲNA( 相当于50 个氨基酸) ，无法很好满足临床使用需求，因而现在普遍使用体外转录法进行生产，即以线性化质粒或PCＲ 产物为模板，通过T7 /SP6 ＲNA 聚合酶转录而成。体外转录工艺已能在每批生产中获得克级以上的mＲNA 治疗药物。质粒DNA 载体是常使用的起始材料，也是一项非常关键的原材料，载体上包含可被ＲNA 聚合酶识别的启动子、编码目标蛋白的开放阅读框、用以转录成非编码区域及多聚腺苷酸尾等的DNA 序列。环状的质粒DNA 需被限制性内切酶( 多聚腺苷酸尾的下游处) 进行线性化处理，将线性化后的质粒进行纯化后，再在其中加入ＲNA 聚合酶、4 种核糖核苷酸以及化学合成的帽类似物进行体外转录反应。反应完成后，先使用DNA 酶( DNase)去除残留的质粒DNA，之后采用磁珠法、沉淀法或层析法对mＲNA 进行纯化。纯化后的产品在完成配制及无菌过滤后即可进行灌装。在生产质量管理方面可参考欧盟颁布的《前沿药物生产质量管理指南》、《药品生产质量管理规范》及无菌制剂附录中的相关要求。由于mＲNA 对ＲNA 酶非常敏感，所以应在生产过程中严格防止与产品直接发生接触的环境、设备容器具及原辅料中可能引入ＲNA 酶的污染。

mＲNA 治疗药物的质量控制及其标准制定方面应以临床前研究批次、临床研究批次和验证批次中检测获得的数据，以及其他相关数据( 如经验、文献报道和稳定性研究等) 确定，检测项目一般应包括鉴别、效价、纯度、杂质( 如无菌、内毒素、外观、pH、渗透压、不溶性微粒控制) 等。对于mＲNA 产品，其质量控制参数的评估应当建立在对其生物学功能以及对生产工艺和生产过程充分理解的基础之上，并兼顾产品的特性和当下的科学认知与共识。

对于在健康人群中使用的mＲNA 疫苗产品，根据临床试验观察结果显示，许多不良反应可能是源于其递送系统，建议企业应按照药品而非赋形剂或辅料的要求对脂质体进行生产及管理。

一般来说，在无ＲNA 酶的情况下，mＲNA 可在室温条件下稳定保存至少2 年以上而不发生明显降解，但不同产品的稳定性保存条件不同，如辉瑞公司的BNT162b2 产品需在－ 70 ℃ 下保存及运输，而Moderna 公司的mＲNA-1273 产品仅需在－20 ℃下保存及运输。因此，研究者仍需要结合产品的特点、临床用药的需求以及保存、包装和运输的情况，科学、合理地开展稳定性方面的研究并制定相应的保存条件。

3 结语

mＲNA 是一种极具潜力的新型治疗产品，随着技术的发展，mＲNA 已被越来越广泛应用于免疫学、肿瘤学、疫苗和先天性代谢疾病等领域的临床研究。然而，安全高效的递送系统、优化的mＲNA 设计及符合商业化生产标准的工艺仍是长期以来限制其临床应用及产业化发展的主要因素。2020 年由于新型冠状病毒肺炎疫情暴发，mＲNA 疫苗的研发及产业化进程被大大提速，预示在不久的将来可能有更多的mＲNA 产品进入市场。

在未来，我们会看到随着世界各国对mＲNA 类产品科学认知的进一步深入，将基于该产品的特性，结合其作用机制及特定的风险，陆续制定并出台更多、更为适用的技术指南以促进技术创新以及适应产业发展需求。