多糖作为自然界中至关重要的大分子，近年来因其广泛的生物活性而备受关注。然而，由于多糖结构的多样性和复杂性，对其进行结构表征极具挑战性。许多多糖在组成上具有异质性，单糖组成也存在差异，因此确定单糖组成是分析多糖结构的关键步骤。目前在多种分析多糖中单糖组成的方法中，先水解后衍生，再用气相色谱或液相色谱结合质谱法分析多糖成分的方法虽然广受欢迎，但难以辨别单糖的绝对构。D-构型单糖虽然在天然糖类中占主导地位，但L-构型单糖也广泛分布于各种多糖中。因此，准确确定单糖的绝对构型对于多糖的全面结构分析至关重要。
一、研究背景
利用手性色谱适合用于单糖对映体的分离。然而，昂贵的色谱柱成本阻碍了它的广泛使用。与对映体相比，在单糖分子中引入一个同种构型的新手性中心，将对映异构体变为非对映异构体。非对映体可以通过传统的C18反相柱达到分离效果。近期，我们团队以 L-半胱氨酸甲酯衍生化（CMED）和超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）为基础，结合Full scan扫描模式和SIM扫描模式对产物进行分析和鉴别，开发了一种可同时测定多糖的单糖类型及其 D/L 构型的新方法，用于单糖类型的综合分析。该方法可同时表征醛糖、酮糖、糖醛酸和糖醇，并对反应机理和副产物进行了详细分析，为新方法提供了坚实的理论基础。
二、研究结果
1. 基于UPLC-MS确定L-半胱氨酸甲酯的衍生机理
CMED衍生法的机理分析
CMED衍生过程分两步反应进行。第一步醛糖、酮糖和糖醛酸的羰基与L-半胱氨酸甲酯之间的亲核加成反应形成噻唑烷或席夫碱衍生物；第二步，单糖羟基的乙酰化。根据R.G.Kallen等人的研究，第一步的产物以噻唑烷或席夫碱形式存在，它们可以发生异构化(图A)。 根据质谱和核磁共振（NMR）检测到的主要产物（图1B-D）和副产推断出了醛糖、酮糖、糖醛酸和糖醇的详细衍生过程。
图1 单糖衍生原理
CMED衍生法产物和副产物分析
使用Q Exactive Focus-Orbitrap MS的全扫描模式对CMED衍生方法的主产物和副产物进行分析。由于醛糖与L-半胱氨酸甲酯的反应可以同时生成席夫碱和噻唑烷，因此副产物主要来源于两者。在进行产物和副产物分析时，研究根据Thermo Scientific Mass Frontier 软件预测醛糖、酮糖和糖醛酸衍生物的碎片离子，在这些单糖衍生物中检测到了希夫碱和/或噻唑烷的产物峰。对于醛糖，以L-Ara为例，主产物为希夫碱衍生物，副产物为噻唑烷衍生物（图A）。根据LC-MS和NMR检测结果，表明酮糖的主产物为希夫碱（图B和图3C），由于双键的存在，所以产生两个顺反异构的色谱峰。与醛糖和酮糖不同，糖醛酸除了生成噻唑烷外，还在碱性条件下通过消除反应在C-4和C-5位生成双键（图C）。糖醇因不含醛基，副产物为L-半胱氨酸甲酯与醋酐的产物（图D）。
图2 Q Exactive Focus-Orbitrap MS 分析不同单糖CMED产物的LC-MS全扫描色谱图
图3各种衍生物的 13C-NMR 数据对比（150 MHz，CD4OD）
2. CMED衍生方法的优化
CMED衍生受到反应温度和时间的影响。研究通过控制两步实验中的不同反应时间和温度来确定最佳衍生条件。首先，在60、70和80℃下用L-半胱氨酸甲酯衍生L-Rib 1小时，并在60℃下以醋酸酐乙酰化30分钟，结果表明副产物的总量在70℃下最少，这表明70℃更有利于衍生。随后，在70℃下以不同的反应时间(30、45和60分钟)衍生L-Rib，并且确定反应时间没有显著影响最终衍生的产物。为确保反应完全，选择60分钟作为反应时间。确定第一步反应的最佳条件后，以L-Rib在60、70、80、90和100℃下确定第二步的最佳反应温度，反应时长皆为30分钟。发现副产物的量随着反应温度的升高而增加。因此，羟基乙酰化的最佳温度被确定为60℃（图4）。
图4 不同温度对 L-Rib 乙酰化过程中产品产量的影响
3. 液相色谱和Q Exactive Focus-Orbitrap MS方法的优化
为实现单糖衍生物在液相色谱中达到较好的分离效果，对液相色谱方法的洗脱梯度、柱温和流速等参数进行了优化。流动相为0.2%FA–乙腈(A)和0.1% FA–水(B)。在未优化液相方法之前，发现这些单糖衍生物的色谱峰有大量叠加的现象（图A）。因此，研究优化了色谱洗脱梯度，新的液相色谱洗脱梯度可以实现大多数衍生物相互分离。此外，为了获得更好的分离度，色谱柱的温度和流动相的流速设置也进行了优化，显著提高了色谱峰之间的分离度（图B）。同时为了提高质谱检测的灵敏度，减少噪音和副产物的干扰，我们优化了质谱仪的扫描参数，将正离子模式下的全扫描切换为 SIM 扫描模式。
图5 液相色谱洗脱梯度条件对衍生物分离的影响
4.应用实例
为了验证方法在天然多糖分析中的实用性，研究选用了黄芪多糖、人参多糖、锁阳多糖、虫草多糖、蕨麻多糖和沙棘多糖对方法进行了分析验证（图B-G）。结果显示，该方法能够准确测定多糖中单糖的类型和绝对构型，并且与文献报道的结果基本一致。在分析的多糖样品中，六种多糖都含有D-Glc，而D-Xyl、L-Ara、D-Man和D-Gal在这些多糖的成分中也经常出现。这种反复出现的现象表明，这些植物多糖的结构组成具有显著的共性。
图6 利用 CMED 方法研究各种植物多糖的单糖组成
在本研究中，为了提高L-半胱氨酸甲酯衍生方法(CMED)的适用性，我们用乙酸酐替代异硫氰酸苯酯，从而使其可用于醛糖、酮糖、糖醛酸和糖醇的分析，鉴定了包含9对对映体在内的26种单糖。根据质谱裂解模式确定了反应机理和可能的副产物。此外，还利用该方法对副产物和产物的稳定性进行了讨论分析，在未来将侧重于提高衍生化的稳定性和效率，以及扩大方法的范围，包括更多类型的稀有单糖。
以上研究成果“Simultaneous determination of the monosaccharide types and their absolute configurations in polysaccharides based on UPLC-MS/MS”已发表在国际知名期刊International Journal of Biological Macromolecules（IF=7.7，中科院1区TOP期刊）。青海大学医学部药学系专业硕士研究生黄永春和白洁为共同第一作者，国家重点实验室张寿德老师为通讯作者。本研究得到国家自然科学基金（22067016）和青海省自然科学基金（2021-QY-203）的资助。
参考文献
Simultaneous determination of the monosaccharide types and their absolute configurations in polysaccharides based on UPLC-MS/MS. DOI:10.1016/j.ijbiomac.2025.139647
