摘 要： 采用亲水作用液相色谱法测定发用类化妆品中的二氨基嘧啶氧化物。目标物由甲醇从样品提取，以Shim-pack Scepter Diol-HILIC-120色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）进行分析，以乙腈-5 mmol/L乙酸铵溶液（体积比60∶40）为流动相，等度洗脱，流量为1.0 mL/min，DAD检测器测定，检测波长为287 nm，外标法定量，亲水作用色谱-串联质谱法确证。二氨基嘧啶氧化物在质量浓度为0.5～10 μg/mL内与色谱峰面积线性关系良好，相关系数大于0.999 5，方法的检出限和定量限分别为0.000 75%和0.002 5%。在膏霜类、乳液类、水剂类3种化妆品空白基质中，0.002 5%、0.005%、0.025% 3种不同添加水平下，平均回收率为89.4%～108.2%，测定结果的相对标准偏差为1.4%～3.2%（n=6）。该方法操作简便，灵敏度高，适用于发用类化妆品中二氨基嘧啶氧化物的定性和定量测定。

关键词： 亲水作用； 液相色谱； 化妆品； 二氨基嘧啶氧化物； 防脱

随着社会的快速发展，由于作息不规律、生活工作压力增大、不良饮食习惯、环境污染等因素导致脱发人群比例不断上升。据统计，我国有超过2.5亿人饱受脱发困扰，且呈现年轻化趋势，急需寻找安全有效的防脱生发产品[1]。1996年美国食品药品管理局(FDA)批准米诺地尔搽剂用于治疗斑秃和雄激素性脱发(AGA)，近年我国也将米诺地尔制剂用于临床治疗脱发等疾病[2]。但是米诺地尔只能用于药品中，并且在治疗过程中可能会产生刺激性皮炎、非特异性过敏反应、面部和四肢多毛症等不可忽视的副作用[3]。我国《化妆品安全技术规范》(2015年版)中明确规定米诺地尔及其盐为化妆品禁用组分。

二氨基嘧啶氧化物，商品名为亚美尼斯，化学名为2，4-二氨基嘧啶-3-氧化物，分子式为C4H6N4O。从化学结构分析，二氨基嘧啶氧化物与米诺地尔有着相似的结构部分，而且与米诺地尔也具有相似的防脱机制。研究证明它能抑制赖氨酸羟化酶（mRNA）的表达，扰乱成纤维细胞产生成熟胶原，具有防止成熟胶原沉积，减少毛囊僵硬收缩，预防脱发[4]等作用。相较于米诺地尔，二氨基嘧啶氧化物更加安全，在防脱固发、生发方面的效果优异，近些年来被我国、欧洲、美国、日本等国家地区批准用于个人发用产品[5]，目前市场上主要是将其与植物提取物、生物活性剂或其他防脱活性成分进行组合配方辅助现代制剂手段应用于防脱洗护产品中[6‒9]，具有广泛的应用前景。

作为特殊类化妆品，防脱类产品功效原料的规范使用和安全性尤为重要。我国《化妆品安全技术规范》(2015年版)[10]中明确规定二氨基嘧啶氧化物限值为1.5%。同时我国化妆品标签管理规定，化妆品标签应当真实、完整、准确[11]，化妆品生产企业应按照标签标示成分真实添加生产原料。目前，关于化妆品中二氨基嘧啶氧化物的检测方法鲜有报道，GB/T 44367—2024《化妆品中限用组分二氨基嘧啶氧化物的测定　高效液相色谱法》为高效液相色谱法测定化妆品中二氨基嘧啶氧化物，使用普通C18柱分析，此类色谱柱对二氨基嘧啶氧化物保留较弱，峰形不理想。

为了限用成分二氨基嘧啶氧化物在化妆品中的安全使用，并改善其在普通C18柱上保留不强及峰形不佳的问题，笔者建立亲水作用高效液相色谱法测定发用类化妆品中的二氨基嘧啶氧化物，能有效增强二氨基嘧啶氧化物在色谱柱上的保留作用，获得比较理想的峰形，适用于化妆品中二氨基嘧啶氧化物的含量测定，同时配套建立亲水作用色谱-串联质谱法作为定性确证方法，为防脱类功效原料二氨基嘧啶氧化物的规范使用和安全性监管提供有效的技术支撑手段。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

三重四极杆液相色谱/质谱联用仪：Agilent 6470型，美国安捷伦科技有限公司。

高效液相色谱仪：e2695型，配二极管阵列检测器，美国沃特世科技有限公司。

超声波清洗器：S300H型，德国艾尔玛公司。

超纯水机：Genie PURIST型，上海乐枫生物科技有限公司。

电子天平：XS205DU型，感量为0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司。

涡旋混合器：IKA Vortex型，艾卡(广州)仪器设备有限公司。

酸度计：PB-10型，德国赛多利斯公司。

乙腈、甲醇：均为色谱纯，霍尼韦尔贸易（上海）有限公司。

甲酸铵：色谱纯，上海麦克林生化科技股份有限公司。

乙酸铵：色谱纯，山东科源生化有限公司。

二氨基嘧啶氧化物对照品：纯度(质量分数)为98.9%，上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 定量分析

色谱柱：Shim-pack Scepter Diol-HILIC-120柱(250 mm×4.6 mm，5 µm，日本岛津仪器有限公司)；流动相：乙腈-5 mmol/L乙酸铵溶液(体积比为60∶40，下同)；流量：1.0 mL/min；检测波长：287 nm；柱温：30 ℃；进样体积：10 μL。

1.2.2 定性分析

(1) 色谱条件

色谱柱：Shim-pack Velox HILIC柱(100 mm×2.1 mm，2.7 μm，日本岛津仪器有限公司)；流动相：乙腈-5 mmol/L乙酸铵溶液(体积比为60∶40)；流量：0.3 mL/min；柱温：30 ℃；进样体积：2 μL。(2)质谱条件

离子源：电喷雾离子源(ESI)；电离模式：正离子模式；检测模式：多反应监测模式(MRM)；干燥气温度：300 ℃，流量为5 L/min；喷雾器压力：0.31 MPa；鞘气温度：250 ℃，流量为11 L/min；毛细管电压：3 500 V；定性离子对为m/z 127.1，83.0，定量离子对为m/z 127.1，110.0。

1.3 实验方法

1.3.1 溶液配制标准

储备溶液：精密称取二氨基嘧啶氧化物标准品10 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至标线，配制成质量浓度为1 000 μg/mL的标准储备溶液，于-18 ℃保存。

系列标准工作溶液：分别精密吸取适量的标准储备溶液，用甲醇稀释，配成质量浓度分别为0.5、1、2、5、10 μg/mL的系列标准工作溶液。

1.3.2 样品处理

称取发用类化妆品样品0.2 g (精确到0.000 1 g)，置于10 mL具塞比色管中，加入3～4 mL甲醇，涡旋振荡30 s使样品与提取溶剂充分混匀，用甲醇定容至标线，超声提取20 min，静置冷却至室温，必要时以10 000 r/min转速离心10 min。取上层清液用0.45 μm滤膜过滤，滤液作为样品溶液。如样品中原料含量超过标准曲线线性范围，可用甲醇适当稀释后进行进样测定。

1.3.3 样品测定

在1.2.1定量分析条件下，分别测定系列标准工作溶液和样品溶液，以系列标准工作溶液的质量浓度为横坐标，对应色谱峰面积为纵坐标，进行线性回归，绘制标准曲线，得到回归方程，用外标法定量。

当定量方法中检出结果出现不确定因素，如检测出产品标签未标示的目标成分、未检出产品标签标示的目标成分以及出现干扰色谱峰等情况影响结果的定性判断时，则要采用1.2.2定性分析条件对样品溶液进行定性确证。在亲水作用色谱-串联质谱法定性方法试验条件下，如果样品中检出色谱峰的保留时间、选择离子对与相当浓度水平对照品溶液中色谱峰一致，即可确证目标物质。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

对二氨基嘧啶氧化物在190～400 nm全波长范围扫描，二氨基嘧啶氧化物的紫外吸收光谱图如图1所示。由图1可见，二氨基嘧啶氧化物在226 nm和287 nm附近有特征吸收峰，最大吸收波长为226 nm左右。但是，使用226 nm作为测定波长提取色谱图时，在目标峰附近出现干扰峰，影响目标峰的准确积分，因此最终选择287 nm作为测定波长。

图1   二氨基嘧啶氧化物光谱图

Fig. 1   Spectrum of diaminopyrimidine oxides

2.2 色谱柱的选择

对比了ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 µm)、Shim-pack Scepter Diol-HILIC-120柱(250 mm×4.6 mm，5 µm)、Kromasil 100-5-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 µm)、Shim-pack Scepter C18柱(250 mm×4.6 mm，5 µm)等4种不同型号色谱柱的色谱分离效果。结果发现，在C18反相色谱柱上，二氨基嘧啶氧化物的保留较弱，出峰时间早，并出现峰形拖尾、分叉等现象，但在HILIC色谱柱上色谱行为表现理想，主要是由于其分子结构中含有胺基等基团，亲水性强，适合使用亲水作用色谱柱分析，因此选择Shim-pack Scepter Diol-HILIC-120柱测定。

2.3 流动相的选择

亲水作用色谱(HILIC)于1990年由Alpert提出[12]，并逐渐广泛运用于药物、环境、食品等领域，近年来在化妆品检测分析领域有一定的应用[13‒15]。亲水作用色谱是通过使用和反相色谱类似的流动相，即有机溶剂相-水相为流动相体系(一般流动相体系中含有较高比例的乙腈)，能有效保留反相色谱中保留不完全或不保留的极性物质，极其适用于极性以及亲水性物质的分析。

分别对比了乙腈-甲酸铵、乙腈-乙酸铵、乙腈-水作为流动相对色谱分析的影响。结果发现，3种流动相体系下的色谱峰表现差异不大，为保持流动相具有一定的缓冲能力，选择乙腈-乙酸铵作为流动相。另外考察不同浓度的乙酸铵及pH值对色谱行为的影响，分别配制5、10、20 mmol/L乙酸铵及调节5 mmol/L乙酸铵溶液的pH值分别为4、5、6及不调pH值等多种情况开展试验，发现二氨基嘧啶氧化物的色谱行为没有明显的差异，因此选择乙腈-5 mmol乙酸铵作为流动相体系。图2为优化色谱条件后的二氨基嘧啶氧化物对照品色谱图。

图2   二氨基嘧啶氧化物对照品色谱

Fig. 2   Chromatogram of 2-aminopyrimidine oxide reference standard

2.4 样品处理方法的选择

二氨基嘧啶氧化物具有较强的极性，试验表明其在甲醇、乙腈、水等溶剂中具有良好的溶解性。根据目标物质的溶解性和化妆品基质的特性，取乳液类化妆品0.2 g，加入二氨基嘧啶氧化物标准储备溶液200 μL，分别以甲醇、乙腈、70%甲醇溶液、50%甲醇溶液、80%乙腈溶液、50%乙腈溶液等作为提取溶剂，按1.3.2样品处理方法考察提取溶剂对回收率的影响，结果见表1。

表1   使用不同提取溶剂时二氨基嘧啶氧化物的回收率

Tab. 1   Recovery rate of diminopyrimidine by using different extraction solvents

由表1可知，使用上述6种提取溶剂得到的加标回收率数据均满足分析要求，未显示明显差别。实验过程中发现，甲醇、乙腈为提取溶剂时样品溶液澄清，易过滤，70%甲醇溶液、50%甲醇溶液、80%乙腈溶液、50%乙腈溶液为提取溶剂时，溶剂中水的含量越高，样品溶液越浑浊，越难以过滤。综合考虑回收率、成本、溶剂的毒性及操作方便等条件，选择甲醇作为样品处理溶剂。

2.5 线性关系及检出限

在设定的仪器工作条件下，取系列标准工作溶液进样测定并记录色谱图。以色谱峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标建立标准工作曲线，计算线性回归方程和相关系数。取质量浓度为1.0 μg/mL的混合标准溶液，用甲醇逐级稀释，按1.2仪器工作条件测定，以3倍信噪比对应的质量浓度作为方法检出限，以10倍信噪比对应的质量浓度作为方法定量限，根据取样质量和定容体积，换算成样品中的含量，以质量分数(%)表示。结果表明，二氨基嘧啶氧化物在质量浓度0.5～10 μg/mL内与对应色谱峰面积线性关系良好，回归方程为y=23 109.6x+3 717.8，相关系数大于0.999 5。取样质量为0.2 g，定容体积为10 mL，方法检出限为0.000 75%，定量限为0.002 5%。

2.6 样品加标回收试验

分别取膏霜类、乳液类、水剂类空白基质各0.2 g，分别精密加入标准储备溶液适量，使添加水平分别为低、中、高3个水平(质量分数为0.0025%、0.005%、0.025%)，每个水平平行制备6份样品，按样品处理方法操作，进样测定，计算加标回收率和相对标准偏差(RSD)，结果见表2，空白样品和加标样品色谱图分别见图3～图8。由表2可见，二氨基嘧啶氧化物在膏霜类、乳液类、水剂类3种基质中的加标回收率分别为89.4%～108.2%，RSD为1.4%～3.2%，可以满足日常质量检测分析的要求。

表2   样品加标回收试验结果

Tab. 2   Results of standard addition recovery test

图3   水剂空白样品色谱图

Fig. 3   Chromatogram of water blank sample

图4   水剂加标样品色谱图

Fig. 4   Chromatogram of water agent spiked sample

图5   乳液空白样品色谱图

Fig. 5   Chromatogram of emulsion blank sample

图6   乳液加标样品色谱图

Fig. 6   Chromatogram of emulsion spiked sample

图7   膏霜空白样品色谱图

Fig. 7   Chromatogram of blank sample of cream

图8   膏霜加标样品色谱图

Fig. 8   Chromatogram of cream standard sample

2.7 稳定性试验

取空白乳液剂样品，加入标准储备溶液适量，使添加浓度水平为质量分数0.025%，按样品处理方法操作处理，置室温下放置0、1、2、4、8、12和24 h时进样测定，结果见表3。由表3可知，在24 h内二氨基嘧啶氧化物色谱峰面积的RSD为2.5%，表明经样品处理的溶液在24 h内稳定性良好。

表3   稳定性试验结果

Tab. 3   Results of stability test

3 结语

建立了高效液相色谱法定量测定防脱护发类化妆品中二氨基嘧啶氧化物。使用亲水作用色谱(HILIC)柱作为色谱柱，有效改善二氨基嘧啶氧化物在常规C18柱上峰型不佳的问题，并增强其在色谱柱上的保留作用，同时配套建立亲水作用色谱-串联质谱法作为定性确证方法。该法样品处理简单，灵敏度高，具有较好的准确度，适用于膏霜类、乳液类、水剂类等常见基质发用类化妆品中限用成分二氨基嘧啶氧化物的检测需求，为防脱类功效原料二氨基嘧啶氧化物的规范使用和安全性监管提供有效的技术支撑手段。

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