摘 要： 建立了高效液相色谱法同时检测化妆品中迪高替尼、托法替尼、乌帕替尼、鲁索替尼4种组分。样品用体积分数为80%的甲醇溶液提取，C18色谱柱分离，二极管阵列检测器检测，检测波长为225 nm。4种组分在各自质量浓度范围内与对应的色谱峰面积线性关系良好，相关系数均为0.999 9；4种组分的检出限为2.48～2.83 μg/g；霜类、乳液类、水剂类3种化妆品基质下，方法回收率为92.6%～100.6%，测定结果相对标准偏差为0.2%～4.1%（n=6）。该方法操作简便、准确快速，适用于化妆品中迪高替尼等4种组分的含量测定。

关键词： 高效液相色谱法； 化妆品； 迪高替尼； 托法替尼； 乌帕替尼； 鲁索替尼

特应性皮炎(AD)是皮肤科常见疾病之一，是一种慢性炎症性皮肤病，临床上以皮肤瘙痒、复发性湿疹样皮疹为特点，儿童患病率大，严重影响患者及其家庭的生活质量[1‒2]。目前，AD的病因尚不完全明确，但有文献报道Janus激酶抑制剂(JAKi)通过阻断Janus激酶的信号通路，抑制Ⅱ型细胞因子而对AD的治疗有一定效果[3‒5]。近年来，多种JAKi获批用于治疗AD，其中乌帕替尼、迪高替尼、鲁索替尼和托法替尼是目前临床最为常用或是最具潜力的Janus激酶抑制剂[6‒14]。《化妆品监督管理条例》第五十九条第三项规定，不得使用禁止用于化妆品生产的原料生产化妆品，不得在化妆品中添加可能危害人体健康的物质。上述几种JAKi类药物，由于其良好的治疗AD效果，有被不法化妆品生产企业违规加入儿童类化妆品或是宣称具有舒缓、修护功效化妆品中的风险。但查阅相关文献，目前尚未有可以检测化妆中迪高替尼等4种组分的方法，使此类风险的监管尚处于空白，给消费者用妆安全带来隐患。笔者建立了可快速、高效地在化妆品中同时检测迪高替尼、托法替尼、乌帕替尼、鲁索替尼4种组分的高效液相色谱检测法。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：岛津LC-20AD型，配有SIL-20AC自动进样器、DGU-20 A在线真空脱气机、CTO-20A柱温箱、SPD-M40二极管阵列检测器，日本岛津仪器公司。

电子分析天平：METTLER TOLEDO XS205DU型，感量为0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

涡旋震荡器：IKA MS3型，德国爱卡公司。

超声波清洗仪：PRIMA PM5-2000TD型，英国普律玛仪器公司。

离心机：赛默飞X1R型，美国赛默飞世尔科技公司。

超纯水发生器：Millipore Milli Q Reference型，美国密理博公司。

迪高替尼、托法替尼、鲁索替尼标准品：纯度(质量分数)分别为99.9%、98.3%、99.9%，上海安谱实验科技股份有限公司。

乌帕替尼标准品：纯度(质量分数)为99%，上海麦克林生化科技股份有限公司。

甲醇：色谱纯，德国默克公司。

1.2 溶液配制

标准储备溶液：分别精密称取迪高替尼、托法替尼、乌帕替尼、鲁索替尼4种标准品约0.01 g (精确至0.000 1 g)于4只10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至标线，摇匀，于-4 ℃下保存。

混合标准溶液：分别精密移取4种标准储备溶液各1 mL于同一10 mL容量瓶中，用80%(体积分数，下同)甲醇溶液稀释至标线，得4种标准品质量浓度均为100 μg/mL的混合标准溶液。

系列混合标准工作溶液：精密移取一定量的4种组分的混合标准溶液，用80%甲醇溶液逐级稀释，得到4种组分质量浓度均分别为0.5、1、2、5、10、25、50 μg/mL的系列混合标准工作溶液。

1.3 液相色谱条件

色谱柱：CAPCELL PAK TYPE MG柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm，厂家)；柱温：40 ℃；进样体积：10 μL；检测波长：225 nm；流动相：A相为水，B相为甲醇；流量：1.0 mL/min；洗脱方式：梯度洗脱，洗脱条件见表1。

表1   梯度洗脱条件

Tab. 1   Gradient elution program

1.4 样品处理

精密称取0.5 g样品(精确至0.000 1 g)于10 mL具塞比色管中，加入80%甲醇溶液8 mL，用涡旋震荡器混匀，超声提取20 min，后用80%甲醇溶液定容至10 mL，必要时于10 000 r/min转速下离心10 min，取上清液经0.45 μm滤膜过滤，滤液作为样品溶液。

1.5 样品测定

在1.3液相色谱条件下，取系列混合标准工作溶液分别进样，进行色谱分析，以系列混合标准工作溶液质量浓度为横坐标，对应的色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。取样品溶液进样，测得色谱峰面积，根据标准工作曲线得到样品溶液中迪高替尼等4种组分的质量浓度。

2 结果与讨论

2.1 液相色谱条件的选择

比较了水-乙腈和水-甲醇为流动相[15]时4种组分的分离效果，结果表明，两种流动相体系下4种组分均能有效分离且色谱峰形较好，但水-乙腈体系下保留时间较短，不利于后期样品检测，水-甲醇体系下保留时间合适且分离度好，故选择水-甲醇作为流动相体系。甲醇作为有机相时，分别试验了10、20 mmol/L乙酸铵缓冲盐溶液对4种组分分离效果的影响。结果发现，水-甲醇体系下各组分峰形已经较好，添加缓冲盐并未使峰形更好。综上所述，选择水-甲醇作为流动相。

2.2 色谱柱温度的选择

比较柱温分别为25、30、35、40 ℃时4种组分的分离效果。结果显示，4种柱温条件下4种组分均能得到有效分离，但随着柱温降低保留时间有所延长，综合考虑，选择柱温为40 ℃。

2.3 检测波长的选择

采用二极管阵列检测器对4种组分进行全波长扫描，扫描范围为190～400 nm，结果如图1所示。由图1可见，迪高替尼在284 nm波长处有最大吸收，托法替尼在286 nm波长处有最大吸收，乌帕替尼在232 nm、340 nm处有最大吸收，鲁索替尼在252 nm、310 nm处有最大吸收，4种组分在短波长区域都有较大的紫外吸收，为了方便试验操作，统筹考虑，选择225 nm作为迪高替尼、托法替尼、乌帕替尼、鲁索替尼等4种组分的检测波长。

1—迪高替尼；2—托法替尼；　3—乌帕替尼；　4—鲁索替尼图1　

4种组分的紫外吸收光谱图

Fig. 1   UV absorption spectrum of 4 components

2.4 提取溶剂的选择

根据前述流动相的种类以及4种组分均较易溶于甲醇的特性，考察了不同体积分数(100%、80%、60%、40%)甲醇溶液作为提取溶剂时样品的提取效果。结果发现，当甲醇体积分数为40%时，4种组分的提取回收率较低，为65%～80%；随着甲醇体积分数的增加，4种组分的提取回收率均有不同程度的增加，当甲醇体积分数为80%和100%时，4种组分的提取回收率无明显差异。综合考虑，采用体积分数为80%的甲醇溶液作为提取溶剂。

2.5 专属性试验

按1.3条件分别测定迪高替尼等4种组分混合标准溶液、空白样品溶液、加标样品溶液，色谱图分别见图2～图4。由图可见，4种组分峰形和分离度均表现良好，样品溶液基质对4种组分的测定无干扰，加标样品溶液与混合标准溶液中4种组分的保留时间一致，表明该方法具有良好的专属性。

 1—迪高替尼；2—托法替尼；　3—乌帕替尼；　4—鲁索替尼

图2　混合标准溶液色谱图

Fig. 2   Chromatograms of mixed standard solution

 1—迪高替尼；2—托法替尼；　3—乌帕替尼；　4—鲁索替尼

图4　加标样品溶液色谱图

Fig. 4   Chromatograms of spiked sample solution

图3   空白样品溶液色谱图

Fig. 3   Chromatograms of blank sample solution

2.6 线性回归方程

取系列混合标准工作溶液在1.3液相色谱条件下进行测定，以各组分的质量浓度为横坐标，对应色谱峰面积为纵坐标进行线性回归，得到回归方程。4种组分在对应的质量浓度范围内与色谱峰面积线性关系良好，相关系数均为0.999 9，结果如表2所示。

表2   4种组分的线性范围、线性回归方程和相关系数

Tab. 2   Linear range，linear equation and correlation coefficient of 4 components

2.7 检出限和定量限

取较低质量浓度的混合标准工作溶液，稀释进样，记录信噪比(S/N)，按S/N为3和10的标准，计算检出限和定量限，结果如表3所示。

表3   4种组分的检出限、定量限

Tab. 3   Detection limit and quantification limit of 4 components

2.8 样品加标回收试验

选取霜类、乳液类、水剂类3类化妆品常见剂型进行加标回收试验。称取3类空白样品各0.5 g，分别加入50、100、500 μL混合标准溶液，制得低、中、高3个浓度水平的加标样品，每个浓度水平平行制备6份，按1.4样品处理进行操作，得到样品溶液并测得其中的迪高替尼等4种组分的质量浓度，计算各组分回收率和测定结果的相对标准偏差(RSD)，结果见表4。4种组分在3类基质下的平均回收率为92.6%～100.6%，RSD为0.2%～4.1%(n=6)。结果表明，该方法在霜类、乳液类、水剂类3类基质中的准确度和精密度均良好。

表4   样品加标回收试验结果

Tab. 4   Results of recovery test of spiked samples

3 结语

建立了同时测定迪高替尼等4种治疗特应性皮炎组分的高效液相色谱法，该方法操作简单，标准曲线线性关系、准确度和精密度良好，为检测化妆品中迪高替尼、托法替尼、乌帕替尼、鲁索替尼等治疗特应性皮炎药物提供了新的方法。该方法的建立有效补充了化妆品非法添加的检测范围，为监管部门的科学监管监测提供技术支撑。

参考文献

1 中华医学会皮肤性病学分会免疫学组，特应性皮炎协作研究中心.中国特应性皮炎诊疗指南（2020版）［J］.中华皮肤科杂志，2020，53（2）： 81.
    Atopic Dermatitis Working Group，Immunology Group，Chinese Society of Dermatology. Chinese guideline for diagnosis and treatment of atopic dermatitis （2020）［J］. Chinese Journal of Dermatology，2020，53（2）： 81.

2 王建琴.中国特应性皮炎诊疗指南（2020版）解读［J］.皮肤性病诊疗学杂志，2020，27（5）： 359.
    WANG Jianqin. Interpretation of Chinese guidelines for the diagnosis and treatment of atopic dermatitis（2020）［J］. Journal of Diagnosis and Therapy on Dermato-Venereology，2020，27（5）： 359.

3 SCHULER C F 4th，BILLI A C，MAVERAKIS E，et al. Novel insights into atopic dermatitis［J］. The Journal of Allergy and Clinical Immunology，2023，151（5）： 1 145.

4 NAKASHIMA C，YANAGIHARA S，OTSUKA A. Innovation in the treatment of atopic dermatitis：Emerging topical and oral Janus kinase inhibitors［J］. Allergology International，2022，71（1）： 40.

5 李妍，李明.系统Janus激酶抑制剂治疗特应性皮炎专家共识［J］.实用皮肤病学杂志，2022，15（3）： 129.
    LI Yan，LI Ming. Expert consensus on the treatment of atopic dermatitis with systemic Janus kinase inhibitors［J］. Journal of Practical Dermatology，2022，15（3）： 129.

6 LEVY L L，URBAN J，KING B A. Treatment of recalcitrant atopic dermatitis with the oral Janus kinase inhibitor tofacitinib citrate［J］. Journal of the American Academy of Dermatology，2015，73（3）： 395.

7 BLAUVELT A，TEIXEIRA H D，SIMPSON E L，et al. Efficacy and safety of upadacitinib vs dupilumab in adults with moderate-to-severe atopic dermatitis：A randomized clinical trial［J］. JAMA Dermatology，2021，157（9）： 1 047.

8 刘艳，田晶，梁源，等.儿童特应性皮炎的新药治疗进展［J］.中国新药杂志，2023，32（19）： 1 959.
    LIU Yan，TIAN Jing，LIANG Yuan，et al. New advancement on the therapy of pediatric atopic dermatitis［J］. Chinese Journal of New Drugs，2023，32（19）： 1 959.

9 殷科蕊，吴紫阳，汪皖青，等. 3种口服Janus激酶抑制剂治疗特应性皮炎的临床综合评价［J］.中国药房，2024，35（12）： 1 419.
    YIN Kerui，WU Ziyang，WANG Wanqing，et al. Clinical comprehensive evaluation of three oral Janus kinase inhibitors for atopic dermatitis［J］. China Pharmacy，2024，35（12）： 1 419.

10 庄昊俊，郭美亮，刘婉雯，等. Janus激酶抑制剂在特应性皮炎治疗中的临床应用研究进展［J］.上海交通大学学报（医学版），2021，41（7）： 963.
    ZHUANG Haojun，GUO Meiliang，LIU Wanwen，et al. Clinical research progress of Janus kinase inhibitors in the treatment of atopic dermatitis［J］. Journal of Shanghai Jiao Tong University （Medical Science），2021，41（7）： 963.

11 韩京宏，刘红. Janus激酶抑制剂治疗儿童难治性特应性皮炎二例［J］.中国麻风皮肤病杂志，2024，40（3）： 190.
    HAN Jinghong，LIU Hong. Two children with refractory atopic dermatitis successfully treated with Janus kinase inhibitors［J］. China Journal of Leprosy and Skin Diseases，2024，40（3）： 190.

12 李娜，衡明莉，王骏.治疗特应性皮炎新药及其临床药理学研究有关问题探讨［J］.药物评价研究，2022，45（9）： 1 894.
    LI Na，HENG Mingli，WANG Jun. Discussion on new drugs and clinical pharmacology studies for atopic dermatitis［J］. Drug Evaluation Research，2022，45（9）： 1 894.

13 何石焕，刘京平.乌帕替尼治疗特应性皮炎的研究进展［J］.现代医药卫生，2022，38（20）： 3 508.
    HE Shihuan，LIU Jingping. Research progress on the treatment of atopic dermatitis with upadacitinib［J］. Journal of Modern Medicine and Health，2022，38（20）： 3 508.

14 KATOH N，IKEDA M，OHYA Y，et al. Safety and efficacy of upadacitinib for atopic dermatitis in Japan：Analysis of the 3-year phase 3 rising up study［J］. Dermatology and Therapy，2024，14（1）： 213.

15 沈红梅，秦明明. HPLC法测定原料药磷酸芦可替尼的含量和有关物质［J］.广州化工，2021，49（2）： 66.
    SHEN Hongmei，QIN Mingming. Determination of related substances in ruxolitinib phosphate by HPLC［J］. Guangzhou Chemical Industry，2021，49（2）： 66.