近期，浙江大学医学院附属邵逸夫医院张文斌教授和王雅楠副研究员在科爱创办的期刊Bioactive Materials上发表研究文章：一种用以调节凝血-炎症相互作用的微环境响应血管支架涂层新策略。本研究通过该涂层抑制血小板-纤维蛋白相互作用和血小板-单核细胞聚集体的形成，有效干扰凝血和炎症反应互作，为优化血管支架设计提供了新的见解。

01研究内容简介

心血管支架虽能通过机械支撑改善血管狭窄，但再内皮化延迟、血栓形成、持续性炎症及晚期支架内再狭窄仍限制其长期疗效。支架植入后引发内皮损伤、炎症、凝血及内膜增生级联反应，其中凝血与炎症通过血小板活化相互作用：血小板通过释放细胞因子（如TNF-α）增强平滑肌细胞（SMCs）迁移增殖，并介导单核细胞聚集，加剧细胞外基质（ECM）的降解与病理性重塑，最终导致管腔狭窄。本研究提出微环境响应性涂层策略：1）采用血小板整合素受体（Gp IIb/IIIa）拮抗剂替罗非班以抑制凝血级联反应；2）设计MMP9响应性纳米颗粒负载丹酚酸A（Sal A），在炎症部位靶向释放以抑制MMP9过度表达，调节单核-巨噬细胞表型转化，同时抑制SMCs的异常增殖并促进内皮细胞再生。通过层层自组装技术整合功能组分，该涂层在动脉粥样硬化兔模型中证实可协同调控凝血-炎症网络，减少血栓形成与炎性因子分泌，加速功能性内皮层的修复，并抑制病理性内膜增生。该策略通过全程动态调控组织反应，为改善血管支架在动脉粥样硬化环境中的长期功能提供了创新性解决方案（图1）。

图1：涂层制备示意图及工作方式。PDA：聚多巴胺、PEI：聚亚胺、GS：纳米粒子、Sal A：丹酚酸A、TIR：替罗非班、OxHA：氧化透明质酸

一、响应性涂层的设计流程

采用EDC/NHS交联法制备了4-羧基苯基硼酸-明胶复合物（CPBA-GEL），并通过¹H NMR验证其结构。利用硼酯化反应将丹参酮A（Sal A）与CPBA-GEL交联，形成粒径约100 nm的纳米颗粒（GS）。实验表明，MMP9可特异性触发Sal A释放：10 nM MMP9作用180分钟后释放率达80%，而无酶对照组仅为20%，背景释放源于苯硼酯键水解及表面分子解附。通过层层自组装构建了PEI/TIR/GS/OxHA功能涂层，紫外光谱证实GS成功嵌入。替罗非班释放实验显示，含GS的涂层具有显著的缓释效果，20天内释放速率低于对照组，归因于GS通过氢键、π-π堆积等作用阻滞药物扩散，且纳米颗粒形成了物理屏障。SEM/AFM分析表明涂层表面均匀，GS的引入并未显著增加粗糙度，但提升了结构的稳定性。因此GS纳米颗粒不仅赋予涂层MMP9响应释药的功能，还通过多重分子作用优化了药物的缓释性能和涂层的结构完整性。

图2：GS纳米颗粒及其涂层的表征。(A) 纳米颗粒制备示意图。(B) GS纳米颗粒的粒径。(C) 37℃下，MMP9响应的GS纳米颗粒在含有0、1、5和10 nM MMP9的PBS中释放的累积Sal A。(D) Sal A、PEI/OxHA、PEI/GS/OxHA、PEI/TIR/OxHA和PEI/TIR/GS/OxHA的紫外可见光谱。(E) PEI/TIR/OxHA和PEI/TIR/GS/OxHA在PBS中37℃时的累积替罗非班释放量。（F-G）不同涂层样品的SEM和AFM图像。标尺，10 μm。

二、涂层对血小板聚集的抑制

血小板是凝血与炎症的关键调控因子，其活化抑制对相关病理过程具有调节作用。本研究通过涂层负载抗凝剂替罗非班来实现凝血调控。抗血栓实验显示，对照组表面呈现大量活化血小板，而PEI/OxHA和PEI/GS/OxHA组活化血小板数量显著降低，其中PEI/TIR/OxHA组因替罗非班作用呈现最强抑制效果，PEI/TIR/GS/OxHA组则展现出综合性能最优。过氧化氢(H2O2)会加剧凝血反应，含Sal A的GS纳米颗粒通过清除自由基增强抗凝效果。在H2O2暴露实验中，对照组与PEI/OxHA组血小板活化显著加剧，PEI/GS/OxHA和PEI/TIR/OxHA组仅出现轻度活化，而PEI/TIR/GS/OxHA组仍保持最佳抗血小板活化性能。实验证实，替罗非班是抗凝作用的主要贡献者，而GS纳米颗粒的抗氧化能力则为其提供了重要协同支持。

图3：涂层的血液相容性和抗炎能力。(A) 在H2O2刺激和不刺激的情况下，涂层上的血小板粘附和活化实验。标尺，10 μm。(B) PMA和LPS处理涂层48小时后细胞形态和THP-1 ROS生成图像。标尺：50 μm、100 μm。(C) PMA和LPS处理THP-1后ROS表达的定量统计。(D) ELISA试剂盒检测THP-1血清IL 6和IL 1β水平。(E) ELISA试剂盒检测THP-1中MMP9的表达。（F-G） PMA和LPS处理THP-1的定量结果和细胞流式细胞术谱图。青色点、红色点和黄色点分别代表CD68⁺、CD206⁺和CD86⁺细胞群。

三、涂层对单核细胞行为的调节

血管支架的抗炎能力对其功能至关重要，因其植入后需应对单核细胞募集引发的炎症反应。激活的单核细胞表型转化会加剧凝血及内皮化障碍。研究采用PMA和LPS刺激THP-1细胞，通过不同涂层（PEI/GS/OxHA、PEI/TIR/OxHA等）共培养48小时后观察发现：涂层组THP-1细胞黏附量减少，其中PEI/GS/OxHA因GS抗炎作用显著降低活化细胞的数量，细胞形态呈卵形；PEI/TIR/OxHA组仍存在假足状弱活化细胞，而PEI/TIR/GS/OxHA对单核细胞活化抑制效果最优。ROS检测显示其生成趋势与细胞活化形态一致，PEI/TIR/GS/OxHA显著抑制ROS水平，并降低促炎因子IL-1β、IL-6释放。GS纳米颗粒同时抑制炎症微环境中单核细胞/巨噬细胞的MMP9表达。流式分析表明，PEI/TIR/GS/OxHA组THP-1细胞CD206（M2表型标志）表达上调，CD86（M1表型标志）下调，CD206/CD86比值显著升高，证实其促进了M2抗炎表型分化。综上，PEI/TIR/GS/OxHA通过调控细胞形态、表型分化及炎症因子分泌，展现出优异的抗炎性能。综上所述，PEI/TIR/GS/OxHA通过调节单核细胞分泌的细胞因子和蛋白的形态、分化和表达表现出优越的抗炎能力。 

四、凝血与炎症相互作用的影响

血栓形成涉及纤维蛋白、血小板与白细胞之间的凝血-炎症相互作用。活化的血小板通过CD61（Gp IIb/IIIa）受体与纤维蛋白原结合形成聚集，替罗非班作为Gp IIb/IIIa拮抗剂可抑制该过程。免疫荧光显示，对照组和PEI/OxHA组存在密集纤维蛋白网络及血小板相互作用，而PEI/GS/OxHA、PEI/TIR/OxHA及PEI/TIR/GS/OxHA组纤维蛋白网络显著减少，平均分支长度缩短，其中替罗非班联合GS的PEI/TIR/GS/OxHA抑制效果最优。

单核细胞通过CD62p与血小板形成聚集体以促进血栓的形成。实验表明，PEI/TIR/OxHA组单核细胞更圆且分散，血小板-单核细胞聚集减少；PEI/TIR/GS/OxHA因GS与替罗非班协同作用，CD11b⁺单核细胞及聚集体数量最低。该涂层通过拮抗Gp IIb/IIIa来抑制血小板聚集与纤维蛋白网络形成，同时干扰单核细胞活化及血小板-单核细胞相互作用，兼具抗炎抗凝特性，显著调控血栓形成与炎症进程。

图4：血栓与炎症的相互作用分析。(A)细胞制备示意图。(B) LPS处理24小时后纤维蛋白和CD61⁺血小板粘附在涂层上的图像。扩增的位置用白色方块标记。标尺：40 μm和20 μm。(C) LPS处理24小时后涂层上CD11b⁺单核细胞和CD62p⁺血小板的图像。标尺，20 μm。(D)纤维蛋白与CD61⁺细胞的面积比。(E)纤维蛋白在涂层上的平均分支长度。(F) CD11b⁺ CD62p⁺区域与CD62p⁺区域的面积比。采用单因素方差分析（ANOVA， t检验）判定不同样本间的差异。

五、SMCs对增殖和迁移的调控

血管支架植入后，平滑肌细胞（SMC）过度增殖和迁移是导致再狭窄的关键因素。本研究通过PDGF-BB刺激HUASMCs以模拟病理状态，评估不同涂层对细胞行为的影响。EDU实验显示，含GS纳米颗粒的PEI/GS/OxHA和PEI/TIR/GS/OxHA组显著抑制HUASMC增殖，共培养模型中PEI/TIR/GS/OxHA表面HUASMC/HUAEC比例最低，体现了选择性抑制特性。QPCR和Western blot证实该涂层下调PCNA、CCND1基因及Cyclin D1蛋白表达水平，提示其通过调控细胞周期相关分子抑制增殖。迁移实验表明，PEI/TIR/GS/OxHA组可抑制MMP2/MMP9 的mRNA和蛋白表达，Transwell结果显示24小时迁移抑制效果最优，证实GS纳米颗粒通过调节ECM降解机制限制细胞迁移。

总的来说，这些结果表明，加入GS纳米颗粒增强了材料在影响平滑肌行为方面的功能。该涂层可有效调节与平滑肌细胞增殖和迁移相关的蛋白和基因的表达，在调节平滑肌细胞紊乱引起的内膜狭窄方面具有潜力。

图5：平滑肌细胞增殖和迁移的调控。(A) PDGF-BB处理48h后涂层上HUASMC的增殖情况。标尺，200 μm。(B)定量分析EDU⁺细胞比例。（C-D）涂层上共培养24h后HUASMCs和HUAECs的免疫荧光图像定量统计。标尺，100 μm。(E) PDGF-BB治疗48小时后HUASMCs中PCNA和CCND1   mRNA水平。（F-H） PDGF-BB治疗后HUASMCs中PCNA和Cyclin D1的Western   blot分析。(I) PDGF-BB治疗48小时后HUASMCs中MMP2和MMP9的mRNA水平。(J) ELISA试剂盒检测HUASMCs中MMP2和MMP9的表达。（K-L）结晶紫染色12和24小时transwell迁移的HUASMCs的定量统计和图像。标尺，200 μm。

六、涂层促进血管支架组织再生

血管支架用于治疗动脉粥样硬化性血管狭窄，但其植入后需应对复杂的病理微环境。本研究通过球囊损伤联合高脂喂养建立兔动脉粥样硬化模型，评估不同涂层修饰PLA支架植入腹主动脉后的修复效果。结果显示，损伤血管斑块周围CD68高表达，而PEI/GS/OxHA、PEI/TIR/OxHA及PEI/TIR/GS/OxHA组CD68显著降低：PEI/GS/OxHA通过GS纳米颗粒的抗氧化与抗炎特性抑制炎症；PEI/TIR/OxHA可能通过减少血小板-巨噬细胞聚集体形成减轻炎症；PEI/TIR/GS/OxHA协同调控巨噬细胞表型及凝血-炎症交互作用，展现出最强的抗炎能力。收缩型平滑肌细胞标志物αSMA和SM22α在PEI/GS/OxHA及PEI/TIR/GS/OxHA组表达显著高于裸支架组，其中PEI/TIR/GS/OxHA因GS抑制SMCs异常增殖迁移而达到最高水平。HE染色显示该组新生内膜最薄，油红O染色提示其斑块脂质含量最低。免疫荧光显示PEI/TIR/GS/OxHA组CD31阳性细胞数最多，eNOS表达同步升高，表明其显著促进再内皮化。综上，PEI/TIR/GS/OxHA涂层通过调控炎症、改善SMCs功能、减少脂质沉积及促进内皮再生实现了血管修复，其协同调控凝血-炎症网络与SMCs行为的策略为动脉粥样硬化治疗提供新方向。

图6：动脉粥样硬化兔支架植入术。(A)兔支架植入研究方案。（B-E）支架植入后腹主动脉CD68、SM22α表达的代表性免疫组化图像及定量统计。标尺，100 μm。(F)植入支架的腹主动脉组织学分析。标尺：400 μm、100 μm。(G)支架植入后内膜厚度定量分析。（H-I） ORO染色支架代表性图像及定量统计。比例尺，400和40 μm。(J)家兔腹主动脉和血管支架内表面的代表性SEM图像。有代表性的定向细胞用红色箭头标记。标尺，50 μm。(K)血管和新生内膜组织中CD31和eNOS的表达。血管支架柱用白色虚线标记。标尺，200 μm。（L-M）腹主动脉支架内CD31和eNOS表达的定量统计。

七、涂层促进血管支架组织再生

本研究通过对兔腹主动脉支架植入6周后的转录组学分析，评估涂层修饰对血管修复的影响。基因热图及维恩图显示，PEI/GS/OxHA、PEI/TIR/OxHA、PEI/TIR/GS/OxHA组较PLA组存在显著差异基因。凝血相关基因ITGA3和SELP表达在替罗非班处理后下降，联合GS纳米颗粒后抑制效果增强。GS纳米颗粒上调M2型巨噬细胞标志物IL-10和ARG1，下调IL-18和IL-1β，促进了抗炎表型转换。内皮与平滑肌标志物同步变化证实GS与替罗非班协同调控细胞功能。富集分析表明，PEI/GS/OxHA组主要关联巨噬细胞分化及MAPK通路；PEI/TIR/OxHA组富集于凝血及IL-17炎症通路；PEI/TIR/GS/OxHA组显著富集凝血反应、ROS通路、VEGF信号及脂质转运通路，GSEA进一步显示其与脂质代谢、PPAR信号及胆固醇代谢相关，提示联合涂层通过调控脂代谢抑制斑块进展。PPI网络分析筛选出COL1A2、COL5A2及SERPINF2等关键基因，参与胶原重构与细胞分化，与抗凝及平滑肌表型转换机制一致。综上，PEI/GS/OxHA侧重于抗炎，PEI/TIR/OxHA主攻抗凝，而PEI/TIR/GS/OxHA联合涂层通过协同抑制炎症-凝血级联及调节脂代谢，实现血管微环境稳态调控。

图7：改良支架涂层在血管修复中的转录组学分析。(A)五组间基因表达热图。(B)   PEI/OxHA、PEI/GS/OxHA、PEI/TIR/OxHA、PEI/TIR/GS/OxHA组和PLA组之间基因差异表达的维恩图。（C-F）考虑内皮细胞功能、SMC表型转变、凝血过程和炎症反应的堆叠小提琴图代表基因表达谱。（G-I） PEI/GS/OxHA、PEI/TIR/OxHA和PEI/TIR/GS/OxHA对PLA的GO富集分析。（J-L） PLA与PEI/GS/OxHA、PEI/TIR/OxHA和PEI/TIR/GS/OxHA的KEGG富集分析。PEI/TIR/GS/OxHA组与PLA组间的（M-O） GSEA富集分析。(P)   Cytoscape中CytoHubba描述的前10个Hub基因的网络图。使用MCC评分对前10个节点进行排名，并以紫色从暗到亮表示。