近日，北京卓诚惠生生物科技股份有限公司研发的“曲霉菌属、新型隐球菌及耶氏肺孢子菌核酸检测试剂盒（PCR 荧光探针法）”获批上市，下面嘉峪检测网与您一起了解一下曲霉菌属、新型隐球菌及耶氏肺孢子菌核酸检测试剂盒（PCR 荧光探针法）在临床前研发阶段做了哪些实验。

1、曲霉菌属、新型隐球菌及耶氏肺孢子菌核酸检测试剂盒的主要组成成分

产品主要组成成分见下表：

2、曲霉菌属、新型隐球菌及耶氏肺孢子菌核酸检测试剂盒的产品预期用途

本试剂盒用于体外定性检测人痰液样本中曲霉菌属、新型隐球菌和耶氏肺孢子菌的核酸 DNA。

本试剂用于肺部曲霉菌属、新型隐球菌和耶氏肺孢子菌真菌感染的辅助诊断，不能单独作为确诊的依据。

适用人群主要为免疫低下、免疫缺陷人群，其他人群应有肺部真菌感染相关指征。

真菌感染常见于免疫低下或缺陷人群，具有较高的发病率和死亡率，其临床症状表现不具有特异性，易被细菌、病毒等感染掩盖，临床上致病菌包括曲霉菌属、隐球菌、耶氏肺孢子菌等，检测多重真菌可用于辅助临床诊断。

本试剂盒的检测结果仅供临床参考，对患者的临床诊治应结合其症状、体征、病史、其它实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。

该产品检测阳性不能确定标本中有活病原菌，检测结果应 结合其他临床诊断综合判断。

本产品对于曲霉菌属的检测不能确认具体菌种，如有必要临床应考虑对于曲霉菌属阳性结果进一步确认感染的菌种。 

3、曲霉菌属、新型隐球菌及耶氏肺孢子菌核酸检测试剂盒的检验原理

本试剂盒分别选取曲霉菌属18s rRNA 基因、新型隐球菌ITS基因和耶氏肺孢子菌mtLSU rRNA 基因中保守的区域设计特异性引物和探针，在样本 DNA 核酸纯化之后采用荧光PCR对DNA进行检测。

本试剂盒采用实时荧光定量PCR技术，PCR扩增过程中，探针与模板结合，其5’端报告基团被Taq 酶 5’→3’外切核酸酶活性切断，使报告基团远离淬灭基团，产生荧光信号。荧光定量PCR仪器根据检测到的荧光信号自动绘制出实时扩增曲线，并计算出样本Ct值（每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数）。曲霉菌属、新型隐球菌、耶氏肺孢子菌荧光标记分别为FAM、VIC、CY5。

本试剂盒反应体系含有dUTP-UDG防污染措施，避免操作产生的假阳性结果；采用内源性内标质控体系，通过内标对待 测样本的采集、运输和提取过程进行监控，避免检测结果的假阴性，内标基因选择人源管家基因RP，荧光标记为ROX。

4、曲霉菌属、新型隐球菌及耶氏肺孢子菌核酸检测试剂盒的主要原材料

1）主要原材料的选择

本产品的主要原材料包括：引物、探针、dN（U）TP Mix、 PCR扩增体系、UDG酶、灭活工程菌。这些原材料均为外购方式获得。引物、探针为开发人自行设计后由专业合成公司合成。

选择有资质的供应商提供的原料，通过功能性试验，筛选出最佳原材料和供应商，制定了各主要原材料的质量标准并经检验合格。

2）企业参考品和质控品的设置情况企业参考品包括阳性参考品、阴性参考品、检测限参考品以及精密度参考品。 阳性参考品P1~P18为试剂盒覆盖的3种阳性病原菌。其中 P1~P8为不同菌种曲霉菌属阳性，其他病原体阴性样本；P9~P16 为不同型别新型隐球菌阳性，其他病原体阴性样本；P17~P18 为耶氏肺孢子菌阳性，其他病原体阴性样本。 阴性参考品N1~N16为种属相近的或引起症状相似的病原菌，分别为白色念珠菌、热带念珠菌、甲型流感病毒、腺病毒、 呼吸道合胞病毒、肺炎支原体、肺炎链球菌、百日咳杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、结核分枝杆菌、少根根霉、 伞枝犁头霉、近平滑念珠菌、卡氏肺孢子菌、兔源肺孢子菌阳 性样本。最低检出限参考品L1~L9为试剂盒覆盖的3种阳性病原菌，其中L1~L4为不同菌种曲霉菌属样本；L5~L8为不同型别新型隐 球菌样本；L9为耶氏肺孢子菌样本。 精密度参考品R1~R3为试剂盒覆盖的3种阳性病原菌混合样本，R0为生理盐水。试剂盒包含阳性对照品和阴性对照品各1支，用于检测过程的质量控制。阳性对照品为添加有内标基因片段的灭活工程菌，覆盖试剂盒可检出的所有目标病原菌，阴性对照品为无核酸酶水。

5、曲霉菌属、新型隐球菌及耶氏肺孢子菌核酸检测试剂盒的）生产工艺及反应体系研究

通过对试剂主要生产工艺的研究，确定了最佳生产工艺。 开发人对样本中可能存在的抑制因素进行了测试，并对样本核 酸提取方法进行了研究；同时对引物、探针、Taq酶、UDG酶、 dN(U)TP、Mg离子等的浓度和体积进行了优化；对反应条件进行优化，包括样本采集处理、UDG酶消化时间、变性时间、退火和延伸温度、循环数的选择等研究，并通过验证最终确定了 最佳反应体系。

6、曲霉菌属、新型隐球菌及耶氏肺孢子菌核酸检测试剂盒的分析性能评估

本产品分析性能评估内容主要包括：核酸提取性能、准确性、精密度、最低检出限、特异性、包容性、竞争性干扰研究 等。开发人开展了有效运行的质量管理体系下生产的三批产品， 在适用机型 ABI 7500 荧光定量 PCR 仪上的性能评估。 在核酸提取效率研究中，比较评估了产品配套使用的核酸提取试剂盒的提取性能，采用不同的提取试剂及痰液消化液， 使用不同浓度、型别/菌种的临床阳性样本进行提取效率、核酸 纯度、重复性、室间精密度、最低检出限的研究，结果表明配 套使用的痰液消化液和核酸提取试剂盒可满足产品使用需求。

在准确度研究中，开发人采用三批成品试剂盒，检测企业 阳性参考品和阴性参考品，以及不同浓度、不同型别/菌种临床 阳性样本和阴性样本。结果表明阳性符合率和阴性符合率均为100%。

在精密度研究中，开发人采用三批成品试剂盒，对精密度参考品以及不同浓度、不同型别/菌种的阳性临床样本及阴性样 本，进行 20 天的重复性检测，评估了日内/批内、日内/批间、 批内/日间、批间/日间、室间/不同操作者之间的精密度。结果 显示：Ct 值变异系数（CV，%）均≤5.0%，试剂盒精密度良好。

在最低检出限研究中，开发人采用三批成品试剂盒，检测系列浓度梯度样本，研究样本包含目标菌的常见型别/菌种，将达到 95%阳性检出率的最低浓度水平作为确定的最低检出限，并进行最低检出限验证。最终确定该产品各靶标最低检出限定 为曲霉菌属、新型隐球菌及耶氏肺孢子菌均为1500 copies/mL。

在包容性研究中，开发人采用三批成品试剂盒，对收集不同地区的各目标菌的阳性样本及不同型别病原体进行检测。曲霉菌属包括：烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、米曲霉、土曲霉、构 巢曲霉；新型隐球菌包括：新生隐球菌新生变种、新生隐球菌 格鲁比变种、新生与格鲁比变种杂合体、格特隐球菌；耶氏肺 孢子菌。结果表明试剂盒对不同菌种及不同型别的病原体均能 正确检出，试剂盒包容性良好。

在特异性研究中，开发人采用三批成品试剂盒，选取与检测目标核酸序列具有同源性病原体、HIV、恶性肿瘤等免疫力低下患者常见感染病原微生物、近源菌、易引起相同或相似的临 床症状、采样部位正常寄生或易并发的其他病原体作为交叉反应研究对象。结果表明：本试剂盒与白色念珠菌、热带念珠菌、 光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、毛霉、少根根霉、 伞枝犁头霉、总状毛霉、马尔尼菲青霉菌、斜卧青霉、草酸青 霉、卡氏肺孢子菌、兔肺孢子菌、瓦氏肺孢子菌、鼠肺孢子菌、 无壳散囊菌、荚膜组织包浆菌、金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、唾液链球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、表皮葡萄球 菌、流感嗜血杆菌、纹带棒杆菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌、柠 檬酸杆菌、乳酸杆菌、鲍曼不动杆菌、无毒结核分枝杆菌、卡他莫拉菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌、嗜肺军团菌、洋葱伯克霍尔德菌、诺卡菌、粘质沙雷菌、奈瑟氏菌属、百日咳杆菌、肺炎衣原体、肺炎支原体、鹦鹉热衣原体、甲型流感病 毒、乙型流感病毒、副流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、 鼻病毒、偏肺病毒、肠道病毒、冠状病毒、博卡病毒、水痘带状病毒、EB 病毒、巨细胞病毒、HIV、肺癌患者样本验证均无 交叉反应。

在干扰性研究中，开发人采用三批成品试剂盒，进行了内 源/外源干扰物质研究及竞争性干扰研究，对样本中可能含有的干扰物质分别进行评价，包括血液、唾液在样本中的浓度不高于15%时，对检测结果无显著影响；针对治疗真菌感染或其他 相关疾病的常见药物如：两性霉素 B（4mg/L）、卡泊芬净 （12.4mg/L）、米卡芬净（13μg/mL）、伏立康唑（4μg/mL）、 伊曲康唑（0.5μg/mL）、氟胞嘧啶（40μg/mL）、他克莫司（15 μg/L）、麦考酚酸（30mg/L）、替诺福韦（1mg/L）、地塞米 松（20ng/mL）、甲强龙（500ng/mL）、多西他赛（10μg/mL）、 培美曲塞（200µg/mL）、二甲双胍（3μg/mL）、阿卡波糖（100 μg/mL ）、PD-1（60μg/mL）进行验证，结果显示内源/外源 干扰物质不会对产品检测结果产生干扰。 在竞争性干扰研究中，三种目标菌当一种病原体在最低检 出限浓度附近，其他病原体为高浓度时，各靶标之间不会产生 竞争干扰。故试剂盒检测结果不受内源/外源干扰物质及竞争性干扰影响。

7、曲霉菌属、新型隐球菌及耶氏肺孢子菌核酸检测试剂盒的阳性判断值研究

对收集的临床样本进行检测，包括各病原菌的不同型别/菌种、不同浓度的临床样本，获得原始的Ct值用于制定各指标的 阳性判断值。对于含有阳性和阴性数据的指标，采用 ROC 曲线 法制定各指标的阳性判断值。并进行了阳性判断值的验证，根据验证结果最终确定了试剂盒的阳性判断值：曲霉菌属 Ct≤ 33.7 为阳性；新型隐球菌及耶氏肺孢子菌 Ct≤36 为阳性。

8、曲霉菌属、新型隐球菌及耶氏肺孢子菌核酸检测试剂盒的稳定性研究

对本产品的实时稳定性、开瓶稳定性、反复冻融稳定性、 运输稳定性以及样本稳定性进行了研究，确定了在各种条件下 本产品及样本的有效保存时间。

实时稳定性：试剂盒储存于-20℃±5℃。分别于不同时间点，对其阴阳性符合率、最低检出限和精密度进行考察。结果 表明试剂盒在-20℃±5℃条件下，试剂盒有效期为 12 个月。

开瓶稳定性：试剂盒开瓶后按照规定储存在 2℃~8℃，试剂开瓶后分别于不同时间，对其阴阳性符合率、最低检出限和精密度进行考察。结果表明试剂盒开瓶后在 2℃~8℃条件下保 存，试剂盒有效期为 15 天。

反复冻融稳定性：试剂盒按照规定储存在-20℃±5℃，试剂盒冻结后再取出置于室温解冻，如此反复冻融数次。将冻融后的产品在不同时间点进行阴阳性符合率、最低检出限、精密 度的考察。结果表明，试剂使用过程中冻融次数不得超过 7 次。

运输稳定性：随机各抽取 3 批多盒试剂，采用模拟运输的方法进行研究。运输目的地选择吉林省长春市以及广东省广州市到达目的地后折返。运输结束后将试剂放置至有效期末，按技术要求对产品外观、阳性参考品符合率、阴性参考品符合率、 精密度和最低检出限指标进行检测，检测结果均符合技术要求； 对样本和核酸保存稳定性及冻融次数进行了研究。结果表明：样本在 2℃~8℃条件下可以保存 72 小时，-20℃±5℃条件 下可以保存 12 个月，-90℃~-70℃条件下可保存 24 个月。冻存的样本反复冻融后应充分混匀，避免5次以上反复冻融。提取后的核酸可于-20℃±5℃条件下保存12个月，反复冻融不超过 5 次。