当分离酸性或碱性样品时，通常需加入一定量的缓冲盐，缓冲盐的浓度及类型如何确定？

1、缓冲盐的浓度

缓冲盐的浓度对离子样品保留值的影响通常较小，浓度一般为10-50mmol/l。

2、缓冲盐的类型

缓冲盐类型的选择，主要取决于所需要的缓冲能力，在反向色谱中，流动相中水相的pH和离子强度在开发对条件微小变化不敏感的耐用方法中非常重要。对于离子型化合物，典型的样品的保留随pH改变而明显变化。通常在pH2到4条件下，保留时间对pH的微小改变稳定性最高。因此建议将这一pH范围作为大多数样品方法开发的起始pH，包括碱性化合物和一般的弱酸。缓冲盐溶液的pH值越接近其pka，缓冲能力越强。一般缓冲盐溶液的pH值应在其pka±1的范围内。

3、缓冲盐的离子缔合（反离子对液相色谱行为的影响与理论解析）

如酸性条件下分离碱性化合物，加入NH4CL，碱性物质离子与反离子相互作用的平衡导致它们相互的溶剂化并形成相关复合物离子：

[碱]+[Cl]− = [碱+ -- Cl−]，在低pH时，碱性化合物被完成质子化，溶液阴离子（如CL-）在流动相中破坏了碱性物周围的水分子并增加其疏水性，导致样品保留时间增加，当盐浓度大于50mM时，保留时间略有下降[4]，这可能是饱和反离子CI-引起的离子相互作用的屏蔽作用。此外还可以添加硫酸钠或者高氯酸钠等改变碱性化合物的保留。

4.缓冲盐的其它性质

缓冲盐的溶解性、挥发性和稳定性（可能与设备、样品和或色谱柱发生作用）对某些分离也很重要。如磷酸盐，在含有高浓度有机相（70%以上），可能会析出；一些缓冲剂放置即降解，贮存或长期使用后其紫外吸收会增加（如：TFA、三乙胺）；一些缓冲盐能通过形成离子对，对样品发生作用（如三氟醋酸缓冲剂与阳离子样品，三乙胺与阴离子样品等）；挥发性的缓冲盐如碳酸胺、甲酸铵、醋酸铵等可应用于蒸发光散射、质谱的检测。

5.pH的选择

通常进行分析方法开发时要求远离化合物的pKa，是远离主成分的pKa还是远离待测杂质的pKa？如果在pKa附件是否方法就不能用？

是各杂质的pKa，只不过平时经常是通过主成分的pKa来代表各杂质，制定远离pKa±2。pKa为化合物的酸碱平衡常数，即在该pH条件下，该化合物处于分子离子状态，分子状态化合物，疏水性较强，即色谱柱保留时间较长；离子状态化合物亲水性较强，及色谱柱保留时间较短。制定的流动相pH在待测组分pKa±2以内，有时也是可用的，只不过可能存在各杂质的色谱行为对pH较敏感，尤其是保留时间。会不会出现裂缝或出现双峰的现象，个人认为通常不会，因为分子离子间也存在相互作用力，除非分子疏水作用、离子的亲水作用大于分子离子间的作用力，才有可能裂缝/出双峰。