摘要

目的：建立测定甲苯磺酸妥舒沙星中对甲苯磺酸甲酯（MTS）、对甲苯磺酸乙酯（ETS）和对甲苯磺酸异丙酯（IPTS）含量的气相色谱质谱法。

方法：色谱柱为HP-1MS（0.250mm×30m，0.50μm），程序升温，进样口温度为260℃。质谱的电离方式为EI，电离电压为70V，离子源温度为250℃，采用正离子MRM扫描方式。对MTS、ETS和IPTS定量离子对分别为m/z91→65、m/z155→91和m/z91→65。

结果：48.779~975.59ng·mL-1MTS、54.586~1091.7ng·mL-1ETS、46.241~924.82ng·mL-1IPTS与峰面积的线性关系良好，相关系数r分别为0.9985、0.9984、0.9988。MTS、ETS和对IPTS平均回收率分别为99.47%、99.15%、98.83%（n=9）。7批样品中对MTS、ETS和对IPTS均未检出。

结论：所建立的方法可用于甲苯磺酸妥舒沙星中对MTS、ETS和对IPTS的含量测定。

关键词

GC-MS-MS法；甲苯磺酸妥舒沙星；遗传毒性杂质；对甲苯磺酸甲酯；对甲苯磺酸乙酯；对甲苯磺酸异丙酯

甲苯磺酸妥舒沙星是广谱抗菌药，对支原体、需氧菌、厌氧菌和大肠埃希菌等多种菌均有抗菌效果，临床上主要用于肺炎、支气管炎等呼吸道感染，泌尿感染，结膜炎、角膜炎和中耳炎等五官科感染[1-4]。甲苯磺酸妥舒沙星为对甲苯磺酸与妥舒沙星形成的盐，合成工艺过程中可能使用到试剂甲醇、乙醇和异丙醇进行提取或纯化，故存在对甲苯磺酸与甲醇、乙醇和异丙醇发生反应生成烷基磺酸酯类物质对甲苯磺酸甲酯（MTS）、对甲苯磺酸乙酯（ETS）和对甲苯磺酸异丙酯（IPTS）的风险。烷基磺酸酯类可与DNA发生烷基化反应，可能引发癌症，属于遗传毒性杂质[5-7]。根据《中国药典》2020年版中“遗传毒性杂质控制指导原则”以及美国食品药品监督管理局（FDA）指南草案和欧洲医药评价署（EMEA）要求，必须对药物或药品中任何可能存在或未在早期合成步骤中予以清除的所有基因毒性杂质进行监测[8]。烷基磺酸酯类基因毒性杂质低剂量就可能引起毒性反应，具有可接受限度值低的特点，对检测方法灵敏度要求较高，目前文献报道主要检测方法为HPLC-MS法和GC-MS法[9-15]。本课题组根据样品不需要进行衍生化前处理的性质特点，GC MS/MS法直接进样，并采用多反应监测（MRM）模式监测，以保证检测方法的灵敏度。建立的方法能够准确测定甲苯磺酸妥舒沙星中MTS、ETS和IPTS的含量，为甲磺酸妥舒沙星的质量控制提供依据。

1仪器与试药

1.1 仪器

Agilent GC-MS-MS 8890-7010B三重四极杆气质联用仪（安捷伦科技有限公司）；电子分析天平为METTLER TOLEDO XP205、METTLER TOLEDO XSE205DU（瑞士梅特勒-托利多有限公司，精度为十万分之一）。

1.2 试药

甲苯磺酸妥舒沙星原料（批号190401、190701、191101、191201、200301、200501、200601；来源：天地恒一制药股份有限公司）共7批次样品，对甲苯磺酸甲酯（MACKU，批号为C13288825，纯度为98%）、对甲苯磺酸乙酯（MACKU，批号为C1364164，纯度为98%）、对甲苯磺酸异丙酯（MACKU，批号为C11462060，纯度为95%）；水为超纯水；N-N-二甲基甲酰胺（分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号为20211118）。

2方法与结果

2.1 色谱条件

采用HP-1MS（30m×0.25mm，0.50μm）色谱柱，进样体积为1μL，进样口温度为260℃，隔垫吹扫为3mL·min-1，分流比为10∶1，淬灭气为4mL·min-1，碰撞气为1.5mL·min-1，柱温/程序升温：50℃保持1min，以15℃升温至230℃保持2min，柱流量1.5mL·min-1，恒流。传输线温度为280℃，离子源（EI）为250℃，电子能量为70eV，增益因子为1，选择离子监测为MRM，质谱MRM监测离子信息见表1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 空白溶液（溶剂）N，N-二甲基甲酰胺。

2.2.2 供试品溶液的制备

取本品适量（约0.15g，批号为200301），精密称定，精密加入5mL溶剂使溶解，作为供试品溶液。

2.2.3 混合对照品溶液的配制

分别精密称取MTS18.79mg、ETS21.76mg和IPTS21.52mg，置同一100mL量瓶中，用溶剂溶解并稀释刻度，摇匀，作为混合对照贮备液；精密量取混合对照贮备液适量，用溶剂进行稀释，配制成含MTS、ETS和IPTS浓度分别为93.95、108.8、107.6ng·mL-1的混合对照品溶液。

2.3 专属性试验

取“2.2”项下3种溶液分别按“2.1”项色谱条件进样测定，记录气相色谱-质谱图，结果总离子流色谱图和离子提取图中显示空白溶剂均不干扰MTS、ETS和IPTS的测定。见图1。

2.4 线性关系考察

精密称取MTS19.91mg，ETS22.28mg，IPTS19.47mg，用溶剂稀释并配制成含MTS、ETS和IPTS浓度分别为9.955、11.14、19.735μg·mL-1的混合对照线性贮备液。分别精密量取混合对照线性贮备液0.5、1、2、4、5、10mL，分别置100mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，分别作为线性溶液。按“2.1”项色谱条件测定线性溶液，以峰面积相对应各成分浓度进行线性回归，得各成分的线性和范围，结果见表2。

2.5 定量限和检测限

精密量取“2.2”项下混合对照品溶液适量，用溶剂进行稀释，信噪比约为10: 1时，MTS、ETS和IPTS定量限分别为16.1、12.5、26.1ng·mL-1；信噪比约为3: 1时，MTS、ETS和IPTS检测限分别为4.16、3.19、7.93ng·mL-1。

2.6 精密度试验

精密量取“2.2”项下混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，连续进样6针，记录气相色谱质谱图。对MTS、ETS和IPTS响应值RSD分别为5.48%、3.85%、6.66%，RSD均小于10%，表明该方法精密度良好。

2.7 稳定性试验

精密量取“2.2”项下混合对照品溶液，在室温放置0、1、2、4、5、6、7、8、12h，分别在取样时间点，精密量取对照品溶液按“2.1”项色谱条件进样测定，记录气相色谱-质谱图。在室温条件下放置12h内，MTS、ETS和IPTS响应值RSD分别为9.79%、9.40%、9.77%，RSD均小于10%，表明该溶液在12h内稳定性良好。

2.8 重复性试验

按照“2.2”项下供试品溶液的制备方法，同法制备供试品溶液6份，进样测定，记录气相色谱-质谱图，结果6份供试品溶液均未检出MTS、ETS和IPTS。采用加样回收法对重复性进行评价，“2.9”项下MTS、ETS和IPTS回收率结果RSD分别为1.73%、2.46%、2.23%，均小于5%，结果表明该方法重复性良好。

2.9 回收率试验

精密量取“2.2”项下混合对照贮备液1、2.5、5mL，分别置100mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，分别作为低浓度贮备液、中浓度贮备液、高浓度贮备液。取供试品（约0.15g，批号为200301），精密称定，分别精密量取低浓度贮备液、中浓度贮备液、高浓度贮备液各5mL，滤过，取续滤液，分别作为低浓度供试品溶液、中浓度供试品溶液、高浓度供试品溶液。分别进样测定，记录色谱图，结果表明回收率均在92.46%~102.84%，该方法准确可靠见表3。

3样品测定及风险评估

采用拟建立的方法测定了天地恒一制药股份有限公司生产的7批次甲苯磺酸妥舒沙星均未检出对MTS、ETS和IPTS成分，结果表明该生产企业生产的甲苯磺酸妥舒沙星原料中存在磺酸酯类遗传毒性杂质风险较低。

4讨论

4.1 遗传毒性及可接收限度

本试验采用遗传毒性预测软件ADMETPre dictor进行预测，进一步确认对MTS、ETS和IPTS具有致突变性。根据ICH和《中国药典》2020年版四部指导原则，可采用毒理学关注阈值（TTC）计算可接受摄入量，TTC是从50%肿瘤发生率（TD50）的剂量简单线性外推到百万分之一发生率的剂量，在使用TTC作为评估原料药和制剂中致突变性杂质的可接受摄入量时，其对应的理论上终生患癌风险为十万分之一。给药周期小于1月，TTC值为120μg·d-1；给药周期1~12月，TTC值为20μg·d-1；给药周期1~10年，TTC值为10μg·d-1；给药周期终生长期（大于10年），TTC值为1.5μg·d-1；可接受限度等于TTC除以每日最大临床剂量。甲苯磺酸妥舒沙星制剂给药周期小于1月，TTC值为120μg·d-1，每日最大临床剂量为2.4g，故甲苯磺酸妥舒沙星中对MTS、ETS和IPTS均可接受限度为0.005%。

4.2 色谱柱优化

通过对3根不同极性填料的毛细管色谱柱进行色谱柱优化，色谱柱分别是色谱柱VF-WAXms（30m×0.25mm，1μm）；色谱柱HP-5M（30m×0.25mm，1μm）、色谱柱HP-1MS（30m×0.25mm，0.50μm）。试验结果表明色谱柱①和色谱柱②分离效果差，色谱柱③能实现MTS、ETS和IPTS较好分离，且溶剂峰不会干扰待测成分的测定，最终选择色谱柱③。

4.3 溶剂选择

甲苯磺酸妥舒沙星在氢氧化钠试液中微溶，在水或三氯甲烷中几乎不溶，在N-N-二甲基甲酰胺或冰醋酸中易溶，故本试验选择N，N-二甲基甲酰胺作为溶剂。

4.4 质谱定量离子的确定

本试验采用MRM监测模式进行测定，在确定性和定量离子对过程中，主要考虑MTS、ETS和IPTS特征碎片离子均小于m/z200且部分碎片离子相同，故本试验采用一个定量离子对和2个定性离子能够更准确地测定。MTS和IPTS离子保留时间不同，而m/z91→65离子对响应较好，故MTS和IPTS均选择m/z91→65离子对作为定量离子对。

4.5 方法学验证

本研究建立了甲苯磺酸妥舒沙星原料中对甲苯磺酸酯类化合物含量测定方法，专属性好、线性范围宽且线性关系良好，该方法灵敏准确可靠，操作简单，可以较好地满足甲苯磺酸妥舒沙星原料中3种对甲苯磺酸酯类化合物的检测，帮助企业进行生产工艺控制以及为药监部门进行监管提供参考。