摘 要： 建立了一种金纳米粒子与花生仁膜碳量子点“关-开”型荧光探针检测苯丙氨酸含量的方法。以花生仁膜为原料，采用水热一步法制备花生仁膜碳量子点（CQDs），研究发现，金纳米粒子能导致CQDs荧光信号的“关闭”，苯丙氨酸的加入能引起体系荧光信号重新“打开”，基于此构建了金纳米粒子-CQDs“关-开”型荧光探针检测苯丙氨酸的新方法。在pH值为9.15的BR缓冲溶液中，5～200 μmol/L范围内的苯丙氨酸能引起CQD-Au体系荧光信号线性恢复，线性方程为ΔIF= 2.72c+ 51.275（r=0.998），检出限为1.25 μmol/L。该方法成功应用于模拟样品中苯丙氨酸的检测。

关键词： 花生仁膜碳量子点； “关-开”型荧光探针； 苯丙氨酸

苯丙氨酸是生物体不能靠自身自然合成的必需氨基酸之一，常作为苯丙氨苄、甲酸溶肉瘤素等氨基酸类抗癌药物的中间体及生产肾上腺素、甲状腺素和黑色素的原料[1]。研究表明，苯丙氨酸作为抗癌药物的载体将药物分子直接导入癌瘤区，既可以抑制癌瘤生长，又可以降低药物的毒副作用，其效果是其他氨基酸的3～5倍[2]。然而苯丙氨酸的不当使用会影响使用者智力发育[3‒4]，因此准确测定苯丙氨酸含量具有十分重要的意义。

测定苯丙氨酸含量的方法主要有分子印迹技术[5]、电化学分析技术[6‒7]、荧光分析技术[8‒9]等，这些方法测定选择性高，灵敏度好，但也存在仪器设备相对昂贵，实验操作相对繁琐等弊端，因此有必要探索一种简单、快速测定苯丙氨酸的新方法。

碳量子点（CQDs）是一种新型碳纳米材料，具有性能稳定、毒性低、水溶性好、易于合成，易于功能化、具有特殊光学特性，已被广泛应用于疾病诊断和治疗[10‒11]、催化降解有机污染物[12]、食品及药物的分析检测[13‒14]等多个领域。笔者以花生仁膜为原料，通过一步水热法成功合成了荧光强度高、发光稳定、粒径均匀，水溶性好的CQDs，在对其发光特性表征的基础上，发现纳米金能对其荧光强度产生明显的猝灭作用，导致量子点荧光信号“关闭”，而苯丙氨酸能重新“恢复”花生仁膜CQDs 的荧光信号，据此构建了“关-开”型荧光探针检测苯丙氨酸的新方法。该方法具有检出限低、选择性较好、检测成本低、仪器设备操作简单、检测过程绿色环保等诸多优点，该方法为苯丙氨酸的定量检测提供了新思路。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

荧光光谱仪：F-7000型，株式会社日立制作所。

电热鼓风干燥箱：101型，北京科伟永兴仪器有限公司。

高速离心机：GTR16-2型，上海料科实业有限公司。

电子天平：CP124S型，感量为0.1 mg，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

色氨酸、酪氨酸，柠檬酸钠：均为分析纯，上海蓝季科技发展有限公司。

苯丙氨酸：分析纯，西安化学试剂厂。

氯金酸：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

BR缓冲溶液：向0.04 mol/L 磷酸、硼酸和乙酸混合溶液中加入0.2 mol/L NaOH溶液，调至所需pH值，即伯瑞坦-罗宾森(Britton-Robinson)缓冲溶液。

花生仁膜：市售散装熟花生，挑选出无破损花生，去壳，小心剥离花生仁外面的红色薄膜。

纳米金(AuNPs)溶液：取适量氯金酸，用超纯水稀释并定容至1 mmol/L，加热至沸腾，然后加入1%柠檬酸钠溶液，充分搅拌至颜色变为酒红色。

实验用水：超纯水。

1.2 实验方法

1.2.1 CQDs溶液的制备

将花生仁膜反复用去离子水清洗干净，置于表面皿中，于45℃烘干，用研钵研细，称取2 g至100 mL反应釜中，加入60 mL超纯水，于200 ℃下恒温8 h，冷却后加入适量超纯水搅拌，调节pH至中性，过滤，滤液高速离心，取上层清液，依次用0.44、0.22 μm微孔过滤器过滤，然后转移至100 mL容量瓶中，用高纯水定容至标线，于4 ℃冰箱保存，备用。

1.2.2 苯丙氨酸检测

移取200 μL CQDs溶液、100 μL AuNPs溶液于10 mL比色管中，加入3.00 mL pH值为9.15的BR缓冲溶液，加入适量苯丙氨酸，用高纯水定容至标线，摇匀，于室温放置3 h后，调节狭缝宽度Ex=5.0 nm，Em=5.0 nm，激发波长为320 nm，测定体系的荧光光谱，采用标准曲线法计算苯苯丙氨酸浓度。

2 结果与讨论

2.1 CQDs的光学性质

2.1.1 CQDs电镜光谱

花生仁膜碳量子点的透射电镜图和粒径分布图如图1所示。从图1可以看出，所合成的量子点呈较为规则的球状，较为均匀的分布在水相体系中，粒径主要分布在（3.5±0.5） nm区间内。

图1   CQDs的透射电镜图和粒径分布图

Fig. 1   TEM image and the size distribution of CQDs

2.1.2 CQDs的荧光特性

考察不同激发波长下花生仁膜CQDs的荧光光谱，如图2所示。从图2可以看出，在220～380 nm 波长激发下，花生仁膜CQDs的荧光发射峰位置随激发波长增加逐渐红移，荧光强度先增加后减小，当激发波长为320 nm时，发射光谱的荧光强度达到最大。CQDs的荧光强度和发射峰位置受激发波长的影响，可能是由于CQDs纳米粒子大小或CQDs表面的缺陷对电磁辐射的选择性差异造成的。

图2   不同激发波长下的荧光强度

Fig. 2   Fluorescence intensity at different excitation wavelengths

1→9谱线λex依次为220、240、260、280、300、320、340、360、380 nm

2.1.3 CQDs的紫外-可见光谱

取200 μL CQDs溶液于10 mL比色管中，加入pH值为7.96的BR缓冲溶液3.00 mL，用高纯水定容至标线，以样品空白为参比溶液测定紫外可见吸收光谱，如图3所示。从图3可以看出，花生仁膜CQDs在270 nm处有一明显的吸收特征峰，这应该是花生仁膜CQDs碳骨架结构中共轭的碳碳双键π－π*跃迁的吸收峰特征，在300～400 nm区间较为明显的吸收可能是由C＝N、C＝O 等基团的 n→π*跃迁所引起。

图3   CQDs的紫外-可见吸收光谱图

Fig. 3   UV-Vis spectrum of CQDs

用花生仁膜CQDs在滤纸上涂写成字，在365 nm紫外灯照射下能观到明显发光效果，如图4所示。

图4   紫外灯下CQD发光

Fig. 4   CQD luminescence under UV lamp

2.1.4 红外光谱分析

用玻璃毛细管取少量制备的花生仁膜CQDs，滴涂在KBr压片表面，测试 CQDs 红外吸收光谱，如图5所示。从图5可以看出，花生仁膜CQDs分别在 3 468、1 632 cm-1 处有强吸收峰。3 468 cm-1处的伸缩振动吸收峰应该是由O—H或者N—H所引起；1 632 cm-1处的吸收峰可能是 C＝O及C＝N 官能团的存在而产生。

图5   CQDs红外吸收光谱图

Fig. 5   Infrared absorption spectra of CQDs

2.2 AuNPs对CQDs的荧光光谱影响

AuNPs能对花生仁膜CQDs的荧光产生明显的猝灭，崔雯雯等[15]已对其猝灭机理做了详细阐述。考察了不同体积的 AuNPs溶液下花生仁膜CQDs荧光强度，如图6所示。从图6可以看出，AuNPs对花生仁膜CQDs的荧光产生明显的猝灭效果，随着 AuNPs溶液用量增加，花生仁膜CQDs荧光信号被线性猝灭，当AuNPs溶液用量达到100 μL时，花生仁膜CQDs的荧光信号已经非常微弱，此时花生仁膜CQDs的荧光信号已成功被AuNPs“关闭”，故选择AuNPs溶液用量为100 μL。

图6   不同体积的AuNPs下CQDs的荧关强度

Fig. 6   Fluorescence intensity of CQDS with different volumes of AuNPs

0→10 AuNPs体积依次为0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μL

2.3 三种芳香族氨基酸对AuNPs/CQDs荧光性质的影响

分别考察了色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸3种芳香族氨基酸下AuNPs/CQDs荧光强度，如图7所示。从图7可以看出，色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸3种芳香族氨基酸均不能直接导致花生仁膜CQDS的荧光猝灭，AuNPs的加入能成功引起花生仁膜CQDs荧光信号的“关闭”，随后分别将3种芳香族氨基酸加入到CQDs-AuNPs体系中，只有苯丙氨酸的加入能够导致体系的荧光信号重新得以恢复，荧光信号被重新“打开”，这可能是由于金纳米粒子、苯丙氨酸、碳量子点三者之间的竞争效应导致，实验条件下金纳米粒子与苯丙氨酸的反应优先于金纳米粒子与碳量子点之间的反应，苯丙氨酸进入体系能够将与金纳米粒子结合的碳量子点被释放出来，从而原有量子点的荧光信号得以恢复，基于此构建了“关-开”型荧光探针检测苯丙氨酸的新方法。

图7   不同芳香族氨基酸下AuNPs/CQDs荧光强度

Fig. 7   Fluorescence intensity of AuNPs/CQDS

2—CQDs+芳香族氨基酸； 3—CQDs+AuNPs； ；4—CQDs+AuNPs+芳香族氨基酸

1—CQDs； ; under different aromatic amino acids

2.4 苯丙氨酸测定的最佳实验条件

2.4.1 最佳pH值

考察不同pH条件下加入苯丙氨酸前后CQDs-AuNPs体系390 nm荧光强度的增加值（IF），如图8所示。从图8可以看出，在pH值为9.15的BR缓冲条件下加入苯丙氨酸能使CQDs-AuNPs体系的荧光信号恢复效果最佳。

图8   不同pH下的AuNPs/CQDs荧光强度

Fig. 8   Fluoresence intensity of diffrent pH for AuNPs/CQDs

2.4.2 最佳反应时间

在pH值为9.15的BR缓冲溶液体系中，每隔1 h测定CQDs-AuNPs-苯丙氨酸体系的荧光光谱，记录390 nm处的体系的荧光强度随时间变化趋势，如图9所示。从图9可以看出，苯丙氨酸与CQDs-AuNPs的相互反应能在1 h内快速反应完全，至少在7 h之内保持稳定，7 h后略有下降，实验选择反应3 h左右进行测定。

图9   时间对测定的影响

Fig. 9   The effect of time on determination

2.5 苯丙氨酸的标准曲线

在1.2.2实验条件下，逐步改变苯丙氨酸浓度，固定激发波长为320 nm，保持狭缝宽度为Ex=5.0 nm，Em=5.0 nm，测定荧光光谱，以苯丙氨酸浓度为横坐标，以CQDs-AuNPs体系在390 nm处加入苯丙氨酸前后的荧光强度增加值（IF）为纵坐标绘制标准工作曲线。试验发现，苯丙氨酸在5～200 μmol/L范围内能引起CQD-Au体系荧光强度线性恢复，线性方程为IF=2.72C+51.275，相关系数r=0.998，由3σ/s得到方法的检出限1.25 μmol/L，表明该方法线性关系良好、灵敏度高、选择性好、检出限低。

2.6 样品测定及回收率

准确移取200 μL的CQDs溶液和100 μL的AuNPs于10 mL的比色管中，加入3.00 mL pH值为9.15的BR缓冲溶液，加入0.5 mL 1.00×10-3 mol/L苯丙氨酸，用高纯水定容至10 mL标线，摇匀，制得模拟样品溶液，按照1.2实验方法，采用标准加入法测定苯丙氨酸并计算回收率，试验结果见表1。

表1   回收率试验结果

Tab. 1   Results of recovery test

3 结语

以花生仁膜为原料，采用水热法成功制备了碳量子点，进一步研究发现金纳米粒子能导致花生仁膜CQDs荧光信号的“关闭”，而苯丙氨酸的加入又能导致金纳米粒子和花生仁膜CQDs体系的荧光信号被重新“打开”，依此构建了金纳米粒子与花生仁膜碳量子点“关-开”型荧光探针简单、快速检测苯丙氨酸的光化学新方法，方法检出限为1.25 μmol/L，模拟样品回收率为93.5%~108.6%。该方法绿色环保、操作简单，可为苯丙氨酸定量检测提供新思路。

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