在微生物学研究的微观世界里，分离、纯化和培养特定微生物是探索其奥秘的第一步。倒平板、划平板和涂布平板这三种基础操作，如同精巧的“微生物外科手术”，构成了获取纯培养物的核心技能。它们看似简单，却是实验成败的关键。

核心灵魂：无菌操作

无论进行哪种操作，无菌操作都是贯穿始终的铁律。所有操作需在酒精灯火焰附近的无菌区进行：

培养皿、培养基、工具预先灭菌。

操作前双手、台面严格消毒。

试管、培养皿开启或关闭时，管口/皿盖需快速掠过火焰。

使用后接种环/涂布棒必须彻底灼烧灭菌，避免交叉污染。

倒平板：构筑微生物的“生长家园”

目的： 将熔化的固体培养基无菌倾倒入培养皿，冷却凝固形成均匀平板，为后续接种提供生长基底。

关键材料：

已灭菌的琼脂培养基（加热熔化并冷却至约45-50℃，手感温热但不烫手）。

灭菌的培养皿。

操作步骤：

1、准备： 点燃酒精灯，在火焰旁的无菌区操作。取出灭菌培养皿，皿盖微开置于一侧。

2、取培养基： 手持熔化并冷却至适宜温度的培养基试管（如三角瓶），在火焰上灼烧管口和盖子。

3、倾倒： 将试管口靠近火焰，打开盖子，迅速将适量培养基（约15-20mL，铺满皿底形成适当厚度）倾倒入培养皿底部。倾倒时避免培养基沾到皿盖或皿壁上缘。

4、覆盖与冷却： 立即盖上皿盖，轻轻水平旋转或前后左右倾斜培养皿，使培养基均匀铺满皿底。

5、凝固： 静置在水平台面上，待琼脂完全凝固（通常室温下10-15分钟）。

6、标记与储存： 在皿底标记培养基名称、日期等信息。凝固后若暂时不用，可倒置（防止冷凝水滴落）于4℃冰箱保存。

关键点与常见问题：

温度： 培养基过热（>55℃）易产生过多冷凝水或烫死后续接种的微生物；过冷（<45℃）则易凝固无法倒平或产生凝块。

厚度： 太薄易干裂，太厚影响观察和分离效果。

均匀性： 旋转/倾斜务必轻柔，确保厚度一致。

冷凝水： 倒好的平板常有冷凝水，使用前可倒置于37℃培养箱短时烘干（约30分钟）。

应用： 制备用于划线分离、涂布、点种或倾注培养的固体平板。

划平板：巧手分离单菌落

目的： 利用分区划线技术，将混合菌样或含菌样品在平板上进行梯度稀释，最终分离得到单个、孤立的菌落（纯培养物）。

关键材料：

制备好的无菌固体平板。

接种环（铂金或镍铬丝）。

菌种（斜面培养物、液体培养物或样品悬液）。

操作步骤：

1、灭菌接种环： 手持接种环，将金属环部分置于酒精灯外焰彻底烧红，再灼烧可能进入试管的金属杆部分，冷却（可接触无菌琼脂或空气中静置数秒）。

2、取样： 灼烧菌种管口，用冷却的接种环蘸取少量菌样。若为液体样品，需确保环内形成菌膜但不滴落。

3、第一次划线（A区）：

左手持平板，开启约30度角（避免空气中杂菌落入）。

将沾菌的接种环在平板边缘约1/4区域（A区）轻轻、密集地“之”字形划线数次，约占平板面积的1/4-1/3。划线时环与平板表面呈约30度角，轻柔接触，避免划破琼脂。

4、灭菌接种环： 灼烧接种环至红热，冷却。

5、第二次划线（B区）：

将冷却环接触A区末端划线的1-2次，然后在紧邻A区的空白区域（B区）划线。划线范围约占剩余面积的1/2，划线方向与A区有一定交叉（如垂直或斜交），线条间留有间隙。

6、灭菌接种环与后续划线（C/D区）：

再次灼烧接种环，冷却。

接触B区末端1-2次，在剩余空白区域（C区）划线。线条更稀疏，覆盖剩余大部分面积。

如需进一步稀释（样品含菌量高），可灼烧后划最后一个D区。

7、完成： 盖上皿盖，灼烧接种环。标记平板（样品信息、日期、操作者）。

8、培养： 倒置于适宜温度培养箱培养。

关键点与常见问题：

冷却： 接种环必须充分冷却再取菌/划线，否则会烫死微生物。

分区与稀释： A区要密，后续区域逐渐稀疏并接触前一区末端，实现有效稀释。

角度与力度： 保持适当角度，轻柔接触表面，避免划破琼脂。

灭菌： 每划完一个区域必须彻底灭菌接种环，是分离成功的关键。

单菌落： 理想状态是在C区或D区获得分散良好的单菌落。

应用： 从混合样品中分离纯化单菌落，是获取纯培养物的最常用方法。

涂布平板：定量分析的铺展术

目的： 将一定体积的含菌液体样品（或稀释液）均匀涂布在已凝固的平板表面，主要用于活菌计数或需要菌苔均匀生长的实验。

关键材料：

制备好的无菌固体平板（表面需干燥，无过多冷凝水）。

含菌液体样品（常为系列稀释液）。

灭菌的玻璃涂布棒（L型弯头）或一次性塑料涂布棒。

微量移液器及灭菌枪头。

操作步骤：

1、样品准备： 准备好适当稀释度的含菌液体样品。

2、加样： 用移液器吸取一定体积（通常0.1mL或0.2mL）的样品，轻轻滴加在平板中央。

3、灭菌涂布棒： 将涂布棒浸入70%酒精中，取出后在酒精灯火焰上引燃（无需烧红），燃尽酒精后稍冷却几秒（或酒精灼烧后待酒精挥发完）。

4、涂布：

左手持平板，开启小角度。

将灭菌冷却的涂布棒接触平板边缘无培养基处（吸走多余酒精/降温）。

将涂布棒轻轻置于平板中央的液滴上，先不移动，让液体被琼脂吸收片刻。

快速、轻柔地旋转平板（或用涂布棒作放射状、同心圆运动），同时用涂布棒将液体均匀地涂布至整个平板表面。确保样品覆盖所有区域，且液体被琼脂充分吸收。

5、完成： 盖上皿盖。涂布棒重新浸入酒精中消毒。标记平板（样品、稀释度、体积、日期）。

6、干燥与培养： 静置数分钟待表面液体完全吸收（或倒置于培养箱短时烘干），然后倒置培养。

关键点与常见问题：

平板干燥： 表面冷凝水过多会稀释样品或导致菌落蔓延。使用前需干燥处理。

涂布棒灭菌与冷却： 必须充分灭菌，并适当冷却，避免烫死微生物。酒精灼烧法高效常用。

涂布技巧： 动作要快而轻柔，确保样品均匀分布，不划破琼脂。避免液体溅到皿盖或边缘。

加样体积： 通常0.1-0.2mL，过多不易涂匀且影响吸收。

静置吸收： 加样后稍等再涂布，有助于液体渗入琼脂，减少流动。

应用： 主要用于菌落计数（计算每毫升样品中的活菌数 - CFU/mL）、抗生素敏感性试验（纸片法/K-B法）、需要菌苔均匀生长的实验（如噬菌体效价测定）。

总结：选择与比较

注意事项：

安全第一： 严格遵守实验室生物安全规范。处理未知或潜在致病微生物应在相应等级（BSL-1/2）生物安全柜中进行。废弃物（如污染平板、枪头）必须按生物危害废弃物处理。

温度敏感性： 倒平板温度、过热接种环对微生物的杀伤是关键控制点。

耐心与练习： 无菌操作和划线/涂布技巧需要反复练习才能熟练掌握。失败是常事，分析原因（污染？划线不当？涂布不均？）是进步的阶梯。

记录： 详细记录实验步骤、样品信息、稀释度、培养条件等至关重要。

倒平板、划平板与涂布操作，是打开微生物世界大门的三把钥匙。通过不断磨砺这些基础技艺，研究者得以分离出纯净的菌株，精确量化微生物群体，为后续的鉴定、生理生化研究及更深入的探索铺平道路。掌握其精髓，方能在这肉眼不可见的王国里游刃有余。