目的：分析在工艺、物料、设施、设备和人员确定的条件下，某制药车间生产无菌产品的能力，并识别生产过程中的薄弱环节。
方法：根据国家药品监督管理局发布指南中提出的无菌工艺模拟（APS）试验“最差条件”，在正常工作条件边缘下对工艺条件进行APS 试验设计，并完成培养基模拟灌装试验。
结果：APS试验包括无菌培养基配制、无菌培养基灌装、冻干压塞、轧盖、培养与检查、促生长试验、环境监测、模拟灌装后清洗等步骤。在此条件下，灌装完成的产品均无微生物生长；对培养14 d后的样品进行微生物促生长试验，科氏葡萄球菌、滕黄微球菌、坚强芽孢杆菌、胶红酵母菌、奥斯陆莫拉氏菌和耐盐枝孢菌均生长良好。结论制药车间的日常无菌灌装工艺、环境、洁净室操作人员的无菌操作技术等的规范，有助于保障生产药品的质量和无菌性。
目前，市场上非终端灭菌产品越来越多，各国对无菌工艺验证的要求也越来越高。2016年至2018年，山东省共完成无菌制剂《药品生产质量管理规范》（GMP）认证94 家/次，其中非最终灭菌产品企业54 家/次，占57. 45%［1］。即使所有与产品无菌性有关的设备部件、容器及原料都经过有效的灭菌处理，仍有可能因各种原因导致产品被污染，产品无菌性得不到保证。故无菌生产工艺的无菌性评估验证必须从整体考虑，其中培养基模拟灌装试验是有效的方法。2010年修订版GMP无菌药品第四十七条要求：“无菌生产工艺的验证应当包括培养基模拟灌装试验。”［2］《药品GMP 指南（无菌药品）》要求，“为确保无菌产品的无菌性，灭菌和无菌灌封工艺须经过充分验证”“应采用培养基代替药品进行灌装对无菌工艺进行验证”［3］。基于各项法规和车间实际情况，为确认一个新的设施、生产线或工艺的冻干粉针车间，会进行至少3 次连续成功的无菌工艺模拟（APS），并每6个月进行1次持续工艺评估［3］，每次至少1批，作为对无菌操作人员卫生水平及无菌操作水平的检定。故本研究中从培养基选择、影响因素考察、试验过程及试验结果等方面对培养基模拟灌装试验展开研究。现报道如下：
1、验证前准备
1.1相关设备及其工艺均应事先通过确认或验证［4］
洁净生产区环境须通过静态验证，空气的悬浮粒子、浮游菌、沉降菌及表面微生物均应符合相应规定；所用物料（西林瓶、胶塞、铝盖）通过相关灭菌验证；主要生产设备（灌装压塞机、无菌隔离器等），以及与生产相关的其他辅助工艺（湿热灭菌、干热灭菌等）均通过确认或验证；操作人员的操作行为需经严格培训，并通过考核。
1.2培养基选择与微生物生长性能
营养肉汤培养基或胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）液体培养基均适用于培养基模拟灌装试验［4］，故初步选定3% TSB液体培养基作为模拟灌装用培养基。为使其能充分适用于本生产车间，参考文献［5］制订《洁净区厌氧菌测试方案》，以检测车间生产环境中的微生物。依据洁净区环境监测规程，由专业人员对洁净区的沉降菌、浮游菌和表面微生物进行取样和监测。微生物按基因测序方法鉴定，细菌按16S rDNA 方法鉴定，真菌按rDNA - ITS扩增法鉴定，结果所有采集到的微生物均可在TSB液体培养基中生长良好，故确定本次APS试验的培养基为TSB液体培养基。其中，腐生葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、土壤罗斯氏菌、沃氏葡萄球菌、科氏葡萄球菌均为需氧菌或兼性厌氧菌，耐冷假单胞菌为需氧菌。
2、APS 试验设计与结果
2.1最差条件选择
《无菌工艺模拟试验指南》中规定：“最差条件并不是指人为创造的超出允许范围的生产状况和环境。为了确认无菌工艺风险控制的有效性，应通过风险评估并结合无菌生产工艺、设备装备水平、人员数量和干预等因素来设计模拟试验最差条件。”［6］美国注射剂协会（PDA）发布的Process Simulation for Aseptically Filled Products 规定：“应对预期的干预进行评估，以确定微生物风险的数量和对产品或工艺的影响。由于干预的复杂性和执行频率，对产品及工艺会产生较高的风险，APS试验中的干预应高于正常频率。”故进行APS试验最差参数选择和干预操作选择，并进行最差条件挑战。详见表1和表2。
表1 无菌工艺模拟试验最差参数选择
表2 无菌工艺模拟试验干预操作选择［7］
2.2APS 试验
APS试验操作流程见图1。具体操作如下。
图1 无菌工艺模拟试验操作流程
无菌培养基配制：配制3% TSB液体培养基，按30 gTSB冻干粉配制成1 000 g TSB液体培养基比例配制。按比例取一定量的注射用水置配制罐中，并冷却至30～35 ℃。按比例称取TSB冻干粉，溶于配制罐中，搅拌溶解，pH控制为7. 3 ± 0. 2，经0. 45 μm和0. 20 μm滤芯过滤后进入无菌储罐。最差条件的存放时限后经终端0. 20 μm除菌滤芯过滤至高位罐，进行无菌灌装加塞操作。
无菌培养基灌装：培养基灌装过程按产品生产工艺操作要求进行模拟，按表1模拟最差的灌装条件和表2模拟固有干预操作和纠正性干预操作，并确保所有模拟干预操作在培养基药液灌装时进行。基于风险评估设计，将所有灌装半压塞好的培养基药液运送至冻干箱，并平均分布于冻干箱上、中、下板层上［6］。整个灌装过程中的剔废品应全部编号并拍照。由质量管理人员对无菌隔离器中的整个灌装过程进行全程观察，并详细记录灌装过程中灌装岗位人员非计划性操作情况。且对整个模拟灌装过程进行全程摄像，便于后续分析和解决问题。
冻干压塞：样品全部进入冻干箱后，关好冻干机小门，对冻干箱抽真空至0. 05 MPa［8］，存放于冻干机内模拟冻干时间，关闭蘑菇阀和抽真空系统，用经除菌过滤的压缩空气破空后再次抽真空至0. 05 MPa，关闭抽真空系统，压塞后破空。
轧盖：对从冻干箱出来的培养基灌装产品进行轧盖。轧盖前剔废的未加塞西林瓶及完整性有缺陷的西林瓶（如西林瓶破裂、漏液）均不送最终培养，但必须每瓶编号并拍照，根据剔废原因标记。
培养与检查：充分摇晃待培养品（确保接触西林瓶内表面）后，倒立放置，于20～25 ℃培养室内至少培养7d；观察后，正放置于30～35 ℃的培养室内至少培养7 d［9］。检查须由具有资质的人员执行，如中途检查在培养室外进行，应对检查时间进行补偿，保证培养的总时间。在检查和转运过程中，若出现意外碎瓶，应拍照并记录［10］。培养基模拟灌装试验的目标遵循EU GMP Annex 1：Manufacture ofSterile Products DRAFT 20200220 提出的“目标应为无微生物生长。任何被污染的单元应致使工艺模拟失败”。
培养基培养后促生长试验：对培养至少14 d结束后的样品取样并进行促生长试验，采用2020年版《中国药典（三部）》要求的5种标准菌（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌）进行促生长测试。此外，采用环境分离菌进行促生长测试，环境分离菌筛选原则有，选取日常环境监测中典型的微生物及出现频率较高的微生物；尽可能从关键区域回收的微生物中选用，如灌装间等；特定环境菌从近期收集到的微生物中选取，尽量在近6个月内，最长不超过12个月。依据《美国药典43版》1113、2020年版《中国药典（四部）》9204 微生物鉴定指导意见和《伯杰氏系统细菌学手册》，本车间每6个月对回收的微生物样本进行鉴定。结果见表3。
表3 洁净区微生物鉴定结果
环境监测与模拟灌装后清洗：对整个模拟灌装过程进行环境监测，确保洁净区的环境在动态中符合GMP要求。模拟灌装结束后，按车间相关清洁规程对设备进行清洁，分别用淋洗法和擦拭法对设备淋洗水和设备表面进行取样，进行残留、微生物限度、细菌内毒素检测［11］，以确定不会对下次生产产生影响。
2.3APS 试验结果
本次APS试验中，灌装完成的产品均无微生物生长；且对培养14 d后的样品进行微生物促生长试验，科氏葡萄球菌、藤黄微球菌、坚强芽孢杆菌、胶红酵母菌、奥斯陆莫拉氏菌和耐盐枝孢菌6种环境分离菌均生长良好。表明本次APS试验成功，该批操作人员按此生产工艺生产的产品无菌性可靠。
3、讨论
该冻干车间基于2010 年版GMP 无菌药品附录、PDA 发布的Process Simulation for Aseptically Filled Products 等法规和指导性技术报告，对整个生产工艺、设备、人员、物料、环境等多个系统，以及无菌过程中产品可能易于被微生物污染的潜在薄弱环节进行APS试验，结果所有灌装完成的产品都达到了零污染的目标，符合高标准无菌保证。可见，该冻干车间在工程设计、生产控制、活动干预、质量体系、人员培训、书面规程、环境控制、环境监测等方面均严格遵守了无菌技术，可保障无菌制剂产品生产过程的无菌性，确保无菌制剂的安全性。本研究结果对实际生产具有指导意义，是日常生产操作的依据，有助于实现与国际医药产业的接轨。
参考文献
［1］胡敬峰，韩莹. 无菌工艺模拟试验中存在的问题与对策［J］.中国药事，2019，33（12）：1395 - 1399.
［2］国家食品药品监督管理局. 关于发布《药品生产质量管理规范（2010 年修订）》无菌药品等5 个附录的公告［EB / OL］.（2011 - 02 - 24）［2021 - 12 - 15］. https：// www. nmpa. gov.cn / xxgk / ggtg / qtggtg / 20110224164501312. html.
［3］国家食品药品监督管理局药品认证管理中心.《药品GMP指南（无菌药品）》［M］. 北京：中国医药科技出版社，2011：271.
［4］潘友文. 无菌生产工艺验证—— 培养基灌装试验［J］.中国医药工业杂志，2002，33（1）：34 - 37.
［5］ISO 14644 - 3：2019（E），Cleanrooms and associated controlled environments —— Part 3：Test methods［S］.
［6］国家食品药品监督管理局. 国家食品药品监督管理局关于发布除菌过滤技术及应用指南等3 个指南的通告（2018 年第85 号）［EB / OL］.（2018 - 07 - 31）［2021 - 12 - 15］.https：// www. nmpa. gov. cn / xxgk / ggtg / qtggtg / 20180911170301439. html.
［7］杨惠毛，田治文，杨文竹，等. 在无菌隔离器内进行冻干制剂生产操作的规范性研究［J］. 中国医药工业杂志，2021，52（12）：1663 - 1669.
［8］李妮勇，刘智勇. 新版GMP 中对无菌工艺验证要求的探讨［J］.机电信息，2011（35）：20 - 24.
［9］石景曼，吕环哲，王民如. 无菌粉针工艺验证—— 培养基模拟灌装［J］. 中国药师，2011，14（6）：902 - 903.
［10］袁松范. 工业指南用无菌工艺生产的无菌产品— 现行GMP［J］. 医药工程设计杂志，2005，26（2）：42 - 50.
［11］国家食品药品监督管理总局. 国家食品药品监督管理总局关于发布《药品生产质量管理规范（2010 年修订）》计算机化系统和确认与验证两个附录的公告（2015 年第54号）［EB / OL］.（2015 - 05 - 26）［2021 - 12 - 15］. https：//www. nmpa. gov. cn / xxgk / ggtg / qtggtg / 20150526120001509. html.
