临床前的制剂策略

在临床前试验中小分子给药的方式包括混悬液、溶液、固体或无定形分散体，下面将一一简要讨论。已有大量的综述探讨与处方开发相关，尤其是与增溶相关的制剂方法，本章的重点是这些方法在非临床试验中的应用。

研究人员应当仔细考虑制定一个总体的处方开发策略，以支持体内研究，以减少时间和资源。这个策略应该是全面的，包括药物靶点识别和验证、长期毒性等早期研究，这些研究最终能支撑人体临床试验。在下一部分，将重点讨论这些策略的开发，之后，将对不同类型的研究实际情况和实例进行详细讨论，包括药理、ADME、毒理和可选择的药物传递方式。

1 制备混悬液剂和纳米混悬剂

混悬液处方是在药物发现阶段应用最为广泛，因其适用于各类化学平台且容易制备。如果该化合物的固体形式与最终开发的一致，混悬液可以替代标准的人体给药剂型（胶囊或片剂），用于预测暴露量。标准的混悬液载体通常是1-10%纤维素混合液，这些纤维素包括甲基纤维素、羟乙基纤维素或阿拉伯树胶，同时加入低浓度（0.1%~0.2%w/v）的非离子型表面活性剂，比如吐温80作为润湿剂。表面活性剂可以降低离子化组分由于电荷作用而形成的团聚。

通常，超声可以减小混悬液的粒径，更利于API的溶解和吸收。超声后获得的粒子直径约为10μm。对于混悬液来说，其中的一个挑战在于早期API的物理性质不够理想，包括无定型的、或者无定型和结晶型的混合。如果没有表征API，那么API批间变异将使得体内研究结果变得混乱不堪。此外，混悬液的物理稳定性也必须检测，保证没有晶型转变，这些转变可能会影响暴露量。现配现用，可能不需要测定这些API性质。

在药物发现阶段越来越倾向于采用纳米粒子混悬剂（Robinow BE，2004，Nat. Rev. Drug Discov 3(4):353-359）。纳米粒子混悬剂是亚微米的胶体体系。与药物微米化不同，微米化的粒子粒径范围一般为2~5 μm。纳米粒子相对于同等质量的更大的粒子拥有更大的表面积，这使得其溶出速率更快。当粒子尺寸很小时（＜200nm），可能增加饱和溶解度。按照Freundlich-Ostwald等式，粒子大小为100 nm时，饱和溶解度大约增加10~15%。（Kesisoglou et al. , 2007，Adv. Drug Rev. 59(7):631-644）。

纳米粒子混悬剂可以采用各种技术在较短的时间内进行小规模制备(Merisko-Liversidege EM et al., 2008, Toxicol Pathol 36（1）：43-48），也可以通过多种途径给药（口服、鼻腔、腹膜或静脉注射）。制备纳米粒子混悬剂的关键问题在于选择（1）混悬剂处方的润湿剂（2）包裹粒子的高分子。该高分子应形成足够的空间位阻，阻止粒子的聚集和粒径增长。应当优化纳米乳化工艺，使成品的粒子分布范围非常窄。这可以尽可能的减小奥斯特瓦尔德熟化，以及粒径增长（Van Eerdenbrugh B et al. 2008, Int. J Pharm 364(1):64-75）。应当在恰当的生物相关的条件下进行体外筛选，并对处方进行表征，以保证在给药过程中，粒子不会聚集(Kesisoglou F et al. 2007, Mol Cancer Ther 6(7):2012-2021) 。应当监测处方的物理稳定性，以保证在货架期内，不会出现晶型转变或者粒径增长。药物发现阶段使用的纳米混悬液的制备将在第三章中讨论。

2 选择适当的pH

pKa在生物相关范围的化合物通常可以通过调节pH制备成溶液。Henderson-Hasselbach等式描述了pH，pKa，以及溶液中化合物的离子型和非离子型的比例。离子型化合物的溶解度通常比分子型的大。通常调节pH以增大离子型的浓度，从而实现更高的溶解度。稀氢氧化钠或盐酸溶液常用于调节pH。应当监测成品的pH，以确保其在试验动物可接受pH范围内。应当确证化合物在该pH条件下的化学稳定性。对于在胃肠道的pH范围内（2~7），溶解度有较高pH依赖性的化合物，在短期试验中，应当采用缓冲体系，以最小化胃肠道内析出的风险。对于静脉给药的处方，如果其pH在6~8以外，缓冲容量应足够低（通常摩尔浓度应当为25 mM左右或者更低），使其不会刺激静脉。

非离子态的分子更容易通过胃肠道黏膜而被吸收。为了解pH改变对溶解度的影响，考虑平衡状态下不同形态的分子的行为是必要的。离子化和非离子化的分子都达到饱和的pH被称为pHmax。对于碱性化合物，当胃肠道转换时，其从pHmax的环境中进入更高的pH的区域中，在相应pH的平衡溶解度可能会导致析晶。对于一般的化合物会存在过饱和的亚稳态，这个状态会持续一段时间，其取决于化合物的本征性质和环境。这增加了药物通量和暴露量（Pole DL 2008, J Pharm Sci 97(3):1071-1088）。

然而，过饱和态会导致药物酸性药物在胃中沉淀，碱性药物在肠道中沉淀，这可能导致暴露量过低和/或变异性较大。在给药体系中加入高分子往往可以阻止和减少沉淀。

另外一个调节pH获得溶液剂的有效方式是原位成盐。该方法是通过加入反离子酸或碱到游离碱或游离酸化合物中。对于离子化合物溶液，对应的反离子不同，饱和溶解度也不同。如果某个游离形式的化合物难以制成制剂（例如可混悬性差、在给药介质中粘性大），那么这个方法可能会有用。在早期的发现阶段进行传统的盐型筛选是不实际的。可以通过原位成盐的方式得到较好的解决。通常，反离子的pKa应低于或者高于游离化合物的pKa 2个单位以上。对于碱性化合物，反离子的pKa应至少比游离碱的pKa低2个单位，而对于酸性化合物，反离子的pKa应至少比游离酸的pKa高2个单位。由于需要的材料数量较小，可以对不同的反离子进行筛选从而获得最佳的组合。需要强调的是，本方法的首要目的在于发现最佳溶解度的处方，因此没有考虑所筛选盐型的长期变异性。

3 制备环糊精复合物

环糊精是一种环形的低聚葡萄糖，其在药物增溶中的应用较多（Stella et al. 2008, Toxicol Pathol 36(1): 30-42）。环糊精有亲水的外缘和疏水的内核。因此，其主要的增溶机理是与亲脂的药物形成非共价键的包合物。如果药物和环糊精分子通过1:1的比例形成复合物，那么溶解度与环糊精的浓度呈线性关系。这种方法的主要优点在于吸收过程中的药物沉淀风险较低。注射给药，复合物解离的主要原因是吸收时和竞争性与血浆的结合(Stella et al. 1999, Adv DrugDeliv Rev36(1):3-16) 。在大多数情况下，解离是完全的，药物快速释放。然而，在某些情况下，药物和环糊精的结合常数（K）非常高（>1x105  M-1），其对药物处置的影响已有报道（Chapman et al. 2006, J Pharm Sci 95(2):256-257）。在一篇精彩的综述中详细描述了结合常数的重要性，并且作者在文中声称，如果结合常数小于1x10-4 M-1，那么大多数难溶性药物采用环糊精复合物给药时，可以提高口服生物利用度（Carrier et al. 2007, J Control Release 123(2):78-99）。 处方中药物和环糊精的浓度也同等重要，因为其会影响复合物平衡。如果吸收程度极小（如鼻腔、肌肉内），或者口服浓缩的环糊精，体内行为将可能受到影响。在药物发现和开发阶段最为常用的是2-羟丙基-β-环糊精（HPβCD）和磺酸丁基-β-环糊精。这些环糊精水溶性极好，溶解度在500 mg/mL以上，同时，其安全性已经广泛研究。这两种环糊精都已经在美国上市的静脉注射处方中应用。临床前数据表明，采用磺酸丁基-β-环糊精静脉给药，与2-羟丙基-β-环糊精相比，引起体外溶血的概率更低（Luck et al. 2010, J Pharm Sci 99(8):3291-3301）。

常用的环糊精浓度约是10-20% w/v。例如，利用环糊精增溶的药物的目标浓度为10 mg/mL，其分子量为500，且形成1:1的复合物，那么SBEβCD的浓度为5% w/v或者 HPβCD的浓度为2.8% w/v。环糊精复合物通常作为pH调节和低水平高分子增加溶解度的补充方法。由于磺酸基的低pKa，SBEβCD在生理pH下，通常带有负电荷，阳离子化合物比中性与SBEβCD结合得更好。因此，如果合适的话，应对化合物的中性和离子形式都进行溶解度筛选。在将来，可以采用计算机模拟的方法指导筛选化合物。

4 表面活性剂

表面活性剂是包含亲水区域和疏水区域的两亲分子。在水溶液中，当浓度大于临界胶束浓度时，表面活性剂会形成聚集体，如胶束。胶束中亲水区域向水方向，而疏水区域向核。如果疏水性是化合物在水溶液中溶解的限制因素，或者分子本身是两亲性的，那么表面活性剂是十分有用的添加剂。通常，化合物的表观溶解度与表面活性剂的浓度呈正比。因此，加入表面活性剂的处方，在吸收时出现沉淀的风险最小。一些作者已经列出了常用的表面活性剂和口服或静注用的浓度（Stickley et al. 2008, Annu Rep Med Chem 43:419-451） 。常用的表面活性剂包括吐温80，Cremophor EL。通常，在临床前处方中表面活性剂的主要挑战在于增溶所需要的量较大，而这与组织的耐受性相关。

某些表面活性剂静脉注射后有过敏反应，例如Cremophor EL和吐温80注射入敏感动物体内（尤其是狗）和人。已有报道采用表面活性剂会改变血浆消除行为。许多表面活性剂对肠内药物转运过程（例如P-糖蛋白转运）有抑制作用。这一现象已得到了广泛证实（Li et al. 2012, Mol Pharm 9(5):1100-1108）。因此，在使用高浓度表面活性剂情况下获得的药代和药动数据的解读要十分小心。已有报道采用聚乙二醇维生素E（Vitamin E-TPGS）提高难溶药物的生物利用度。但是在口服聚乙二醇的长期试验中，由于聚乙二醇部分的水解，导致维生素E的吸收降低。因此在设计处方时，表面活性剂的性质和浓度应当仔细考虑。

5 使用共溶剂增溶

在发现阶段，有机共溶剂体系是非常有用的。共溶剂可以改变水溶液系统的极性，提供更有助于非极性溶质溶解的环境。大多数共溶剂的特征在于有可以与水发生强烈相互作用的氢键供体或者受体，在任意比例下与水互溶。碳氢键区域可以减小水溶液系统排出非极性分子的能力。因此，共溶剂体系是增加非极性分子在水溶液中溶解性的高度可行和有力的手段。常见的共溶剂包括N-甲基-吡咯烷酮，2-吡咯烷酮，二甲亚砜，PEG400，二甲基乙酰胺。溶解度与共溶剂浓度呈现对数-线性关系。

因此，以共溶剂为基础的处方，如果处方浓度接近其最大溶解度，那么在口服或非胃肠道给药的吸收过程中会出现过饱和。可能出现沉淀，从而导致表露量过低或变异性大。口服给药时，可以添加少量的高分子或表面活性剂，减缓沉淀。共溶剂的毒性和耐受性是需要考虑的问题，通常在高剂量（必须采用大剂量的共溶剂）试验或长期试验中（例如毒性试验）限制共溶剂的使用。当在静脉注射的处方中使用时，可能造成溶血。Reed和Yalkowsky建立起可以评价处方溶血风险的体外筛选方法（1985，J Parenter Sci Technol 39(2): 64-69）。

此外，由于其离子抑制作用，共溶剂（尤其是PEG400）会干扰生物分析方法。由于与辅料同时出峰，目标化合物的分析信号响应会降低。如果这一问题得到确认，那么采用改变HPLC方法、减少或去除干扰辅料，便可以解决这一问题。

6 脂质体

对于高logP（>4）的分子，脂质为基础的处方具有很大的吸引力。这类处方包括简单油形成的乳剂、微乳、自乳化和自微乳化的药物传递系统（SEDDS/SMEDDS）。SEDDS和SMEDDS是脂质、表面活性剂和共溶剂的混合物，其分散在水溶液中形成乳剂或微乳剂，能够有效地增加高亲脂分子的暴露量Williams et al. 2013, Pharmacol Rev 65(1):315-499）。

这类制剂的体内行为取决于其在胃肠道内的行为。例如，由长链甘油三酯组成的处方可以被脂解，消化后的产物会被胆酸盐-卵磷脂复合物进一步增溶，这会形成良好的胶体分散体，该分散体会越过首过代谢，主要通过肠道淋巴吸收。因此相比于通过门静脉系统这一标准机制吸收的增溶化合物，采用脂质体的生物利用度更大。例如，睾酮衍生物的脂质体处方口服给药，靶点为淋巴系统，同时能减少首过代谢时肝中的暴露量。

适用于该处方的化合物，其在脂质体系统中的溶解度应当足够高，以满足动物试验中的给药需求。载体/给药制剂中的化合物的物理和化学稳定性有时会是长期使用的主要障碍，应当仔细研究。脂质体可能降低药物的使用量和试验持续时间，应当评价其临床药理参数，安全性和耐受性。尽管有这些障碍，但脂质体的优点是很大的。Chen等人提供了将脂质体包含进药物发现流程图中的一种策略。某些生物靶点的本身性质决定其无法与普通方法制备的药物结合，这一策略是极具价值的（Chen XQ et. al.,2012, J Med Chem 55(18):7945-7956）。

7 固体分散体

无定型固体分散体制成的口服处方制剂在药物发现阶段有极大的关注。其在动物和人体试验中增加暴露量。采用相对安全的辅料，可以小规模制备固体分散体。无定型固体分散体处方是将无定型的药物分散在载体基质上。给药后，API形成过饱和溶液，增加通过肠道膜的药物通量。如果采用恰当的高分子材料，可以维持过饱和状态几个小时，从而克服低溶解度造成的吸收困难（Vo et al. Eur J Pharm Biopharm 85(3):799-813）。

制备无定型固体分散体的高分子和其他辅料通常比前面描述的制备简单处方辅料的可接受日摄入量（ADI）要大，固体分散体对于较长时间的试验是有吸引力的选择。近些年，已有许多创造性的产品采用固体分散体形式，已经上市。在药物发现阶段采用固体分散体处方已有报道。我们在Lilly的经验表明，无定型分散体已经在口服给药的毒性和临床研究中成功应用，能够显著地改善血浆暴露量，减小变异性。

相对于前面描述的制剂方法，固体分散体更复杂性。固体分散体处方的物理和化学稳定性应当仔细评价，以保证在研究过程中处理和储存的稳定性。通常，其开发过程首先包括小规模试验，选择高分子和药物的组合，以实现最佳的溶出曲线，接下来是更大一些规模，但仍然是毫克级别规模的试验，以评价处方的热力学性质和物理/化学稳定性（Qian et al. J Pharm Sci 99(7)：2941-2947）。制备无定型固体分散体，应当过量加入原辅料以弥补制备和处理过程中的损失。因此，选择该种处方，仅仅是某些化合物没有其他制剂手段可选，或者体内研究中的特殊需求使得在其他可选制剂处方中使用的辅料不能使用的。