微生物计数：MPN、CFU与滤膜法

一、MPN、CFU与滤膜法：

1.MPN（most probable number）法：

MPN（most probable number）法：即最近似数法，也称为最大可能数法，是食品检验中常用的方法。1915年，McCrady首次发表了用MPN法 (最大可能数法) 来估算细菌浓度的方法， 这是一种应用概率理论来估算细菌浓度的方法。

MPN法：利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度。因为细菌在样本内的分布是随机的，所以检测细菌时，可应用概率理论计算菌数，实验结果以MPN值表示，但MPN值并不能表示实际菌落数， 实际菌落数有可能落在置信区间内的任何一点，MPN值是落在这个置信区间内概率最大的一点。

举例说：稀释度为 1，0.1，0.01所对应的阳性管数分别为 2-0-0。

查MPN检索表可知：

MPN值为90 cfu/100g, 当置信度为95%，则其下限和上限分别为10，360，即对应的菌落浓度区间为10~360 cfu/100 mL(g)，意思是：这个检验结果显示细菌浓度落在10-360cfu/100g区间均有可能，只不过90cfu/100g出现的概率最大，概率为31.9%。

2.CFU (colony forming units）法：

CFU (colony forming units）法：CFU即菌落形成单位，样品经过处理培养后我们数出平板上所生长出的菌落个数，从而计算出每毫升或每克待检样品中可以培养出多少个菌落，以CFU/mL或CFU/g报告之。

CFU法：平板菌落计数法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的现象进行的,也就是说一个菌落即代表一个单细胞。计数时,先将待测样品作一系列稀释,样品经适当稀释后，其中的微生物充分分散为单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成的肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。

3.滤膜法（membrane filter method）：

滤膜法（membrane filter method）：将一定量水样注入已灭菌的微孔薄膜的滤器中，经过抽滤，细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴于培养基上，经培养后计数和鉴定滤膜上生长的菌落，依据过滤水样计算每升或每100毫升水样中的菌落总数。

滤膜法：在压力差的作用下，悬浮液中的液体（或气体）透过可渗性介质（过滤介质），直径大于网孔直径的菌体为介质所截留，从而实现样品和菌体的分离。然后将滤膜放在适当的培养基上进行培养，菌体可直接在膜上生长，从而可直接计数。

二、优缺点：

（一）、MPN优缺点：

•优点：操作简便、灵敏度较高，时间短，可直接观察试管得出结论，若发酵培养基产气，24h 即可报告控制菌阳性，否则观察48小时。每个接种稀释度均有重复，重复次数越多，误差就会越小。

•缺点：要求样品具有均一性，适合检验液体样品，用于检验在发酵培养基中产气的菌种。

•注意事项：需选择合适的稀释度和接种量。

MPN局限性

 •相同MPN值，但含义不同：

MPN值为90时，有四种不同情况的阳性管数。阳性管数为“0-0-3”“0-1-2”对应的最大概率(Pmax)极小，此时的MPN值 90 MPN/100 mL(g)无意义。阳性管数为“0-3-0” 对应的最大概率(Pmax)为0.00417%，而国标中并没有列出相应的95%置信区间，是考虑到该置信区间过广，已没有很大的指导意义。而阳性管数为“2-0-0”的最大概率(Pmax) 为31.91613%，表明实际的菌落数在10~360 cfu/100 mL(g)之间。相同的MPN值，代表的实际菌落数范围却有很大的差别。假如你的产品标准为100 MPN/100 g，实测值为90 MPN/100 g (阳性管数“0-3-0”)，那么很难判定你的产品是否合格。

 •MPN值非连续：

 在MPN表中，MPN值是不连续的。例如我国某些产品的大肠菌群标准为100 MPN/100 mL(g)或 450 MPN/100 mL(g)，但在MPN表中却没有相应的阳性管数。

 •MPN值的准确度随Pmax的减小而减小。

在MPN表中，可见不同MPN值对应的Pmax值不同，且随着Pmax值的减小，MPN值的准确度也明显下降，所以在《FDA细菌学手册》中已删除了极低Pmax值(<0.004%)的情况，因为这些Pmax值对应的MPN值没有实际的指导意义

 •MPN法检测的隐性成本。

 •MPN法是一种采用数学理论推算，用置信区间描述菌落浓度的一种间接计数法。虽然实验结果以MPN值表示，但MPN值并不能表示实际菌落数，实际菌落数是落在置信区间内的任何一点。 

 假如你产品的大肠菌群标准为30 MPN/100 g。而当你某个样品的检测结果为90 MPN/100 g，那么你可能会认为你的产品不合格。但是,90 MPN/100 g的置信区间为10 ~ 360 cfu/100g，那部分结果为90 MPN/100 g的产品，实际菌落数是在10~30 cfu/100g之间，有可能会被当作不合格产品处理。

另外，置信区间为<5~90 cfu/100 g (阳性管数0-0-1)或<5~130 cfu/100 g (阳性管数0-1-0)，检测结果均为30 MPN/100g，也就是说部分实际菌落数为30~130 cfu/100g的产品，会被当作合格产品，从而增加微生物风险。

（二）、CFU优缺点：

•优点：

1、能测出样品中的活菌数，直观，能够直接读数。

2、平板菌落计数法通常做梯度稀释，所以计数的线性范围大。

3、由于是菌悬液涂布，所以比较均匀，能较好的反应菌落的疏密程度。

4、灵敏，平行性较好。

•缺点：

1、手续较繁，而且测定值常受各种因素的影响。

2、厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，比较难检测出。

3、菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。

4、长成的一个单菌落也可能来自样品中的2～3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。

5、检验时间长

•注意事项：样品需要充分均匀以及选择合适稀释度和接种量，检验过程必须严格无菌，以防污染杂菌。

（三）、滤膜法优缺点：

•优点：

1、可以检测大量的样品。

2、浓缩效应使微生物检测的准确度提高。

3、带有菌落的滤膜，可作为检测的永久记录存档。

4、可见的菌落和样品量直接对应，得出定量结果。

•缺点：

1、成本高。

2、操作要求高。

•注意事项：对样品的流动性要求比较高，并且含菌量不能太高。

三、分类以及操作方法：

MPN法：根据需要以及检验的精度不一样可使用9管法以及15管法；其中9管法通常用作食品检验，而15管法用在饮用水的检验（15管法的精度要高些）；基本操作：样品梯度稀释—接种—培养24小时—观察结果—查表报告。

CFU法：有平板倾注法，一般检验使用的方法；平板涂布法，用于细菌含量比较高，并且要求知道细菌菌落形态（只计数特定细菌），基本操作一般包括：样品的稀释—倾注平皿—培养48小时—计数报告。

滤膜法：检测特定种类菌常用方法，应用越来越广泛；基本操作一般包括：样品—过滤—贴滤膜—培养—计数报告。

四、适用性：

MPN法：适用于具有特殊生理功能的微生物类群或者检测带有大量竞争菌的食品及其原料和未经处理的含少量金黄色葡萄球菌的食品（土壤、污水、牛奶等）。

CFU法：应用广泛，是检验、菌种分离、纯化等用得最多的方法（固体、液体样品均可）。

滤膜法：主要应用于洁净度较高的样品，并且样品的流动性决定了可操作性。

五、卫生学意义：

两者都是检测的活菌数，MPN是通过极大近似值然后估计，求出分布函数中的参数、置信区间，再估计；但是CFU通过数据直接求数学期望，平均值和方差。

测定结果判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，一定程度反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。