多糖（Polysaccharide）作为天然产物中主要的生物活性物质和能量来源，在过去的几十年里受到了广泛的关注，大量研究表明天然多糖具有多种生物活性。枸杞、香菇和木耳等来源多糖被证明具有抗氧化和免疫调节活性。此外，多糖因其特殊的流变性、热学和凝胶结构特性而被应用于食品、材料和制药行业。多糖是由单糖或简寡糖缩合而成的多聚物。 植物多糖是植物细胞代谢所产生的聚合度超过10个的聚糖，不能再水解的糖类统称为单糖，单糖可以依据其碳数的不同分为丙糖、丁糖、戊糖、己糖等，植物中的单糖以己糖（六碳糖）和戊糖（五碳糖）为主，常见的单糖有葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、阿拉伯糖等，单糖的详细信息见表1。 准确测定单糖组成对阐明多糖的性质和结构至关重要，有助于进一步了解其构效关系。

表1 天然多糖中常见单糖的信息

多糖单糖组成分析的难点主要体现在以下几个方面:（1）多糖的复杂性使单糖难以完全分离；（2）不适当的水解条件会导致单糖的降解；（3）单糖结构相似，许多单糖互为外聚体；（4）存在单糖异构体的可能性；（5）单糖亲水性强；（6）单糖一般缺乏任何固有的荧光或色基。

单糖组成分析，多糖的解聚是第一步，这一步是通常通过酸水解、酸甲醇水解、物理辅助水解和酶水解进行。单糖的回收率与水解程度密切相关，水解程度受多糖性质的影响，如单糖的种类、糖苷键的位置和类型以及糖基的各种取代。此外，还应考虑检测前释放单糖的稳定性。自从纸色谱法20世纪40年代首次应用于测定碳水化合物，其他的检测方法也陆续出现了，包括薄层色谱、气相色谱（GC）、高效液相色谱（HPLC）、毛细管电泳（CE）、高性能阴离子交换色谱（HPAEC-PAD）。以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生-HPLC法测定单糖组成为例，多糖的单糖组成测定流程见图1。

图1 PMP柱前衍生化-HPLC法测定单糖组成流程

酸水解是目前最普遍、最有效的多糖解聚方法，主要利用硫酸（H2SO4），三氟乙酸（TFA）和盐酸（HCl）在加热条件下水解。水解过程相对简单，而如图2a所示的酸水解反应机理则相当复杂，糖苷键的裂解是由糖苷O原子或O环原子的质子化引起的，以形成异位碳正离子。随后，它可与水反应形成α、β-异构体单体糖的混合物，并释放一个质子。环O原子的质子化和/或单体糖的突变可以形成α,β-吡喃糖和α,β-呋喃糖环形式。一般来说，主链上的糖苷键比分支链上的糖苷键更稳定；吡喃糖形式的糖苷键比呋喃糖形式的糖苷键更稳定；醛糖形式比酮糖形式更稳定；糖醛酸比中性和碱性糖更稳定。然而，在苛刻的条件或较长的处理时间下，酸水解除了会导致多糖中糖苷键的裂解外，还可能导致释放的单糖过度降解。在这种情况下，一些糖可能会降解为非糖，从而加深反应的颜色。因此，确保最佳的水解强度和水解时间是必不可少的，同时也需要在单糖的最大解离和最小破坏之间取得微妙的平衡。

图2 β-D-半乳聚糖酸水解(a)和酸甲醇水解(b)TFA水解是单糖释放的一种有效方法。TFA在水解后通过蒸发很容易被去除，这省去了中和的步骤，造成的损失更少。TFA因其温和的水解能力而比H2SO4更适合水解果胶，特别是含鼠李糖的果胶。此外，TFA也被作为半纤维素的水解剂。不过TFA对纤维素聚合物、粘蛋白多糖的水解能力较弱。

HPAEC、HPLC和GC是目前单糖检测的常用分离方法，见图3。这些平台可以与各种检测器相结合，如折射率(RI)紫外线(UV)，脉冲安培检测(PAD)，质谱(MS)、荧光灯和其他一些探测器。在实践中，研究者们发现每种方法都有自己的优点、缺点和适用范围。在根据多糖的特性选择检测方法时，应考虑多糖的性质、数量和实验条件。即使使用同一台仪器，不同检测之间的设备和校准也存在差异。虽然现有的检测分离技术正在逐步完善，但仍面临许多问题和挑战。大多数GC、HPLC技术由于缺乏显色或荧光基团，往往需要衍生化，可能存在不完全衍生化，造成单糖的损失。HPAEC-PAD具有高灵敏度，不需要衍生化，但PAD不能提供摩尔检测器响应，为定量测定必须提供每种分析单糖的标准。因此，开发更多的绝对定量技术是单糖成分分析的发展方向之一。

图3 HPAEC、HPLC和GC检测原理

参考文献

[1] Liu D , Tang W ,  Yin J Y , et al. Monosaccharide composition analysis of polysaccharides from natural sources: Hydrolysis condition and detection method development[J]. Food Hydrocolloids, 2021, 116(3):106641.