摘 要： 建立超高效液相色谱法同时测定香橼中6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香叶木苷和5，7-二甲氧基香豆素的含量。选择HSS T3 C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）为分析柱，以甲醇-0.1%甲酸溶液为流动相进行梯度洗脱，流量为0.25 mL/min，柱温为30 ℃，检测波长为329 nm。6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香叶木苷、5，7-二甲氧基香豆素的质量浓度分别在0.49～7.82、6.16～98.56、5.81～92.96、0.45～7.23 μg/mL范围内与色谱峰面积线性关系良好，相关系数均大于0.999，定量限分别为0.24、3.08、1.49、0.23 μg/mL。样品加标平均回收率为95.9%～98.1%，测定结果的相对标准偏差为1.1%～1.8%（n=6）。该方法可用于香橼药材质量控制与评价。

关键词： 超高效液相色谱法； 香橼； 6，7-二甲氧基香豆素； 橙皮苷； 香叶木苷； 5，7-二甲氧基香豆素

香橼为芸香科柑橘属植物枸橼Citrus medica L.或香圆Citrus wilsonii Tanaka的干燥成熟果实，具有疏肝理气、宽中化痰的功效[1]。香橼最早以“枸橼”之名收载于《本草经集注》中，附在豆蔻条下[2]； 《本草图经》在橘柚项下记载了枸橼“如小瓜状，皮若橙而光泽可爱，肉甚厚，切如萝卜，虽味短而香氛，大胜柑橘之类，置衣笥中，则数日香歇”。“香圆”之名首见于《本草品汇精要》，主流基原为枸橼，至明代《滇南本草》才以“香橼”之名列出，其基原增加了香圆[2]。

香橼为药食同源品种，含有黄酮类、香豆素类、挥发油类、生物碱类和萜类等活性成分，其中黄酮类成分主要有柚皮苷、橙皮苷、香叶木苷、野漆树苷、橙皮素等，香豆素类成分包括6，7-二甲氧基香豆素、5，7-二甲氧基香豆素、佛手苷内酯、酯滨蒿内酯、氧化前胡素等[3‒8]。橙皮苷具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等活性[9]，香叶木苷具有抗炎、降糖、降压和保护心肌等作用[10]，6，7-二甲氧基香豆素和5，7-二甲氧基香豆素均具有抗氧化、抗肿瘤活性[11]。

香橼收载于国家标准始于《中华人民共和国药典》1963年版， 《中华人民共和国药典》 2020年版一部收载了香橼药材和饮片，药材项下有性状、鉴别、香圆的含量测定项目；饮片项下仅有性状项目；枸橼药材和饮片项下均无含量测定项目。香橼的常见伪品有小柚子、枳壳和佛手，其与香橼饮片外观性状较近似，不易区分。现行的香橼质量标准中涉及的检测项目较少，需要不断进行完善，以更好地控制香橼药用质量。目前，香橼质量控制研究主要集中在柚皮苷、橙皮苷的含量测定。香橼的两个基原香圆、枸橼的化学成分存在一定差异，香圆的主要成分为柚皮苷，枸橼的主要成分为橙皮苷[12‒13]。吴笛等[14]研究发现，根据橙皮苷与5，7-二甲氧基香豆素的色谱峰面积的比值可简便而准确地区分佛手与枸橼，但未测定二者含量。枸橼种质资源丰富，果实形态差异显著，给鉴别及质量控制带来一定困难[15]。笔者以枸橼为研究对象，通过优化样品处理条件和色谱条件，首次采用超高效液相色谱法同时测定了香橼中6，7-二甲基香豆素、橙皮苷、香叶木苷和5，7-二甲基香豆素4种成分含量。该方法简单、快速，准确度高，可为香橼质量控制和评价、资源开发利用等提供实验依据。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

超高效液相色谱仪：Acquity Class型，配有PDA检测器、Empower工作站，美国沃特世公司。

数控超声波清洗器：KQ-600GDV型，昆山市超声仪器有限公司。

高速万能粉碎机：FW100型，天津市泰斯特仪有限公司。

电子天平：MS204TS型，感量为0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多仪器公司。

橙皮苷对照品、6，7-二甲氧基香豆素对照品：质量分数分别为97.2%、100.00%，中国食品药品检定研究院。

5，7-二甲氧基香豆素对照品、香叶木苷对照品：质量分数分别为98.80%、95.84%，成都普菲德对照品科技有限公司。

甲醇、乙腈：均为色谱纯，安徽天地高纯溶剂有限公司。

甲酸：优级纯，国药集团化学试剂有限公司。

实验用其余试剂均为分析纯。香橼样品：经暨南大学药学院马志国教授鉴定为芸香科植物枸橼Citrus medica L.的干燥成熟果实，市售。

实验用水为超纯水。

1.2 色谱条件

色谱柱：HSS T3 C18柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm，美国沃特世公司)；流动相：A相为甲醇，B相为0.1%甲酸溶液，流量为0.25 mL/min；洗脱方式：梯度洗脱，洗脱程序见表1；柱温：30 ℃；进样体积：1 μL；检测波长：329 nm。

表1   梯度洗脱程序

Tab. 1   Gradient elution program

1.3 溶液制备

1.3.1 系列混合标准工作溶液

精密称取6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香叶木苷、5，7-二甲氧基香豆素对照品适量，加入适量甲醇配制成质量浓度依次为7.82、98.56、92.96、7.23 μg/mL的混合溶液，作为混合标准贮备液。香叶木苷需先用二甲基亚砜溶解后，再加入甲醇稀释定容。精密量取混合标准贮备液0.625、1.25、2.50、5.00、7.50 mL，分别置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至标线，摇匀，即得系列混合标准工作溶液。

1.3.2 样品溶液

取香橼样品粉末(过3＃筛)约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，称定质量，超声处理30 min (功率为500 W，频率为40 kHz)，冷却，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即为样品溶液。

1.4 测定方法

取系列混合标准工作溶液和样品溶液，按1.2色谱条件进样测定，记录色谱图，以各成分质量浓度为横坐标，以对应色谱峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，采用标准曲线法计算样品中各成分的含量。

2 结果与讨论

2.1 样品处理条件选择

取香橼样品粉末样品，分别选用甲醇、60%甲醇溶液、乙醇为提取溶剂，考察不同溶剂对4种成分的提取效果，结果见表2。由表2可知，以甲醇作为提取溶剂时，提取效果较好；60%甲醇溶液提取效率次之；以乙醇为提取溶剂时，提取液色谱峰形较差。综合考虑，选择甲醇为提取溶剂。

表2   不同提取溶剂时4种成分的测定结果

Tab. 2   Determination results of 4 components in different extraction solvents

以甲醇为提取溶剂，分别考察超声提取、加热回流提取对4种成分的提取效果。结果表明，2种提取方式对4种成分的测定结果无明显影响，超声法简单、方便。综合考虑，选用超声提取法。

以甲醇为提取溶剂，采用超声提取法处理样品，分别考察不同超声时间(20、30、45 min)的提取效果，结果见表3。由表3可知，超声30 min时可实现对4种成分的有效提取，故选择超声(功率为500 W，频率为40 kHz)时间为30 min。

表3   不同超声时间时4种成分的测定结果

Tab. 3   Determination results of 4 components at different ultrasonic time

2.2 色谱条件选择

2.2.1 检测波长

采用PDA检测器，在200～400 nm范围内扫描样品溶液，采集光谱图。结果表明，6，7-二甲氧基香豆素分别在229、345 nm处有较大吸收，橙皮苷在284、329 nm处有较大吸收，香叶木苷在254、348 nm处有较大吸收，5，7-二甲氧基香豆素在255、329 nm处有较大吸收。综合考虑吸收波长、各成分色谱峰面积、杂峰干扰等因素，确定检测波长为329 nm，一方面可以保证各成分在该波长处有较大吸收，另一方面保证各成分色谱峰面积相对较大，提高检测灵敏度，使测定结果更加准确。

2.2.2 流动相

分别考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸溶液和乙腈-0.1%甲酸溶液3种流动性体系，进行梯度洗脱。结果发现，以甲醇-0.1%甲酸溶液作为流动相时，4种目标物的色谱峰分离效果、峰形较好，且基线较为平稳，故选择甲醇-0.1%甲酸溶液作为流动相。

2.2.3 柱温

选用不同柱温进行试验，柱温分别设定为25、30、35 ℃。在该温度范围内，随着柱温升高，4种目标物的色谱峰保留时间均逐渐缩短，峰形、峰面积、分离度均无明显变化，3种温度均能满足系统适用性试验要求。综合考虑色谱峰分离效果、柱温箱控温效果等因素，选择柱温为30 ℃。

2.2.4 流量

选用不同流量进行试验，流量分别设定为0.20、0.25、0.30 mL/min。当流量为0.25、0.30 mL/min时，4种目标物的色谱峰峰形、分离度均较好，当流量为0.20 mL/min，4种目标物的色谱峰峰形对称性、分离度均降低。为减少流动相用量，保护环境，选择流量为0.25 mL/min。

2.2.5 色谱柱

分别选用HSS T3 C18柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)、BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)、CORTECS T3 C18柱(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)对4种目标物的分离效果和色谱峰形进行考察。结果表明，当使用HSS T3 C18柱时，分离度、色谱峰形均较好，且基线较平稳，因此选择HSS T3 C18柱作为分析柱。

2.3 系统适用性试验

取混合标准溶液、样品溶液，分别按1.2色谱条件进样测定，色谱图如图1所示。由图1可以看出，在样品溶液和混合标准溶液色谱图中，6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香叶木苷、5，7-二甲氧基香豆素保留时间一致，理论板数均大于5 000，分离度均大于2.0，表明系统适用性良好。

图1   混合标准溶液、香橼样品溶液色谱图

Fig. 1   Chromatogram of mixed standard solution and sample solution of Citri fructus

1—6，7-二甲氧基香豆素； 2—橙皮苷； 3—香叶木苷；4—5，7-二甲氧基香豆素

2.4 线性方程与定量限

取系列混合标准工作溶液，按1.2色谱条件分别进样测定，记录色谱图，以各成分质量浓度为横坐标(x)，以对应色谱峰面积为纵坐标(y)，绘制标准工作曲线，计算线性方程和相关系数。将质量浓度最低点的混合标准工作溶液用甲醇逐级稀释，分别进样测定，以10倍信噪比(S/N)对应的质量浓度为定量限。4种成分的线性范围(质量浓度)、线性方程、相关系数及定量限见表4。由表4可知，4种成分在一定的质量浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999。

表4   4种成分的线性范围(质量浓度)、线性方程、相关系数及定量限

Tab. 4   Linear ranges (mass concentration)，linear equations，correlation coefficients，and quantification limits of four component

2.5 稳定性试验

按1.3.2方法制备样品溶液，分别在第0、2、6、10、16、24 h，按1.2色谱条件进行测定，记录4种成分色谱图，结果见表5。由表5可知，4种成分色谱峰面积测定结果的相对标准偏差分别为1.4%、1.8%、1.9%、1.3%，表明样品溶液在24 h内具有较好的稳定性。

表5   稳定性试验结果

Tab. 5   Stability test results

2.6 加标回收与精密度试验

取香橼样品粉末，按照所建立的方法测定4种成分含量。然后取约0.25 g样品，共6份，精密称定，分别置于具塞锥形瓶中，精密加入混合标准贮备液3 mL，按1.3.2方法制成加标样品溶液，在1.2色谱条件下测定，分别计算回收率和相对标准偏差，结果见表6。由表6可知，6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香叶木苷、5，7-二甲氧基香豆素加标平均回收率分别为98.1%、96.9%、95.9%、97.7%，相对标准偏差分别为1.2%、1.1%、1.5%、1.8%，说明该方法具有较高的准确度和良好的精密度。

表6   样品加标回收与精密度试验结果

Tab. 6   Results of samples spiked recovery and precision test

3 结论

建立了超高效液相色谱法同时测定香橼中6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香叶木苷和5，7-二甲氧基香豆素4种成分含量，对样品处理条件、色谱条件等进行了优化。

(1) 该方法操作简单，高效快速，准确度高，能较好地对香橼的药用质量进行评价和控制。

(2) 试验发现枸橼中橙皮苷与5，7-二甲氧基香豆素的色谱峰绝对峰面积比值均大于1，与吴笛等[14]研究结果一致。橙皮苷与5，7-二甲氧基香豆素为区分枸橼和佛手的2个差异性成分，根据橙皮苷与5，7-二甲氧基香豆素的色谱峰绝对峰面积比可以准确地区分佛手和枸橼，且该方法对不同产地、采收期的佛手与枸橼具有较好的普遍适用性。

(3) 枸橼为佛手的原变种，实际使用中存在二者混淆或互相代替使用的情况，研究结果可为枸橼的基原鉴定、质量控制和临床使用提供参考。

(4) 采集的样品均为枸橼，具有较好的代表性。下一步拟采集较多香圆样品，进一步开展枸橼和香圆化学成分差异性研究，为提高香橼的药用质量标准提供实验依据。

参考文献

1 国家药典委员会.中华人民共和国药典（2020年版）：一部［M］.北京：中国科技医药出版社，2020.
    National Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People's Republic of China （2020 Edition）：Part Ⅰ［M］. Beijing：China Medical Science and Technology Press，2020.

2 王艺涵，赵佳琛，金艳，等.经典名方中柑橘属皮用药材的本草考证［J］.中国现代中药，2020，22（8）： 1 185.
    WANG Yihan，ZHAO Jiachen，JIN Yan，et al. Herbal textual research on classical prescription of medicinal material pericarps of Cirtus spp.［J］. Modern Chinese Medicine，2020，22（8）： 1 185.

3 王惠，李聃.香橼的化学成分和药理作用研究进展［J］.中国民族民间医药，2024，33（6）： 63.
    WANG Hui，LI Dan. Research progress on chemical composition and pharmacological effects of Citron（Citrus Medica L.）［J］. Chinese Journal of Ethnomedicine and Ethnopharmacy，2024，33（6）： 63.

4 岑如愿，李娜，林振华，等.基于化学计量学对柑橘属果实类药材间的差异性研究［J］.广东药科大学学报，2024，40（3）： 1.
    CEN Ruyuan，LI Na，LIN Zhenhua，et al. Study on the difference between Citrus fruit medicinal materials based on chemometrics［J］. Journal of Guangdong Pharmaceutical University，2024，40（3）： 1.

5 陈婷，张文，朱仁愿，等. UPLC-Q-TOF/MS结合化学计量学对不同产地香圆主要成分的研究［J］.中国民族民间医药，2023，32（22）： 47.
    CHEN Ting，ZHANG Wen，ZHU Renyuan，et al. UPLC-Q-TOF/MS combined with chemometrics for the study of the main components of Citron［J］. Chinese Journal of Ethnomedicine and Ethnopharmacy，2023，32（22）： 47.

6 严辉，高明亮，查玉玲，等.香橼化学成分和药理作用研究进展及其质量标志物预测分析［J］.中国现代应用药学，2022，39（7）： 976.
    YAN Hui，GAO Mingliang，ZHA Yuling，et al. Research progress on chemical components and pharmacological effects of Citri Fructus and predictive analysis on its quality marker［J］. Chinese Journal of Modern Applied Pharmacy，2022，39（7）： 976.

7 冼伟光，袁瑜贵，扎西罗布，等.香橼叶片和果实挥发性香气成分研究［J］.佛山科学技术学院学报（自然科学版），2022，40（4）： 73.
    XIAN Weiguang，YUAN Yugui，ZHA Xiluobu，et al. Study on volatile aroma components from Citrus wilsonii leave and fruit［J］. Journal of Foshan University（Natural Science Edition），2022，40（4）： 73.

8 李建绪，王红程，高美华，等.枸橼果实的香豆素和黄酮类成分研究［J］.药学研究，2013，32（4）： 187.
    LI Jianxu，WANG Hongcheng，GAO Meihua，et al. Coumarins and flavonoids from the fruits of Citrusm edica L.［J］. Journal of Pharmaceutical Research，2013，32（4）： 187.

9 龚远翔，严鑫，曾逸佳，等.陈皮化学成分与药理活性研究进展［J］.广东化工，2024，51（20）： 96.
    GONG Yuanxiang，YAN Xin，ZENG Yijia，et al. Research progress on chemical constituents and pharmacological effects of Citri Reticulatae Pericarpium［J］. Guangdong Chemical Industry，2024，51（20）： 96.

10 孔晓悦，李聪慧，张凯，等.香叶木苷的药理作用研究新进展［J］.黑龙江医药，2017，30（4）： 724.
    KONG Xiaoyue，LI Conghui，ZHANG Kai，et al. New progress in pharmacological activities of diosmin［J］. Heilongjiang Medicine Journal，2017，30（4）： 724.

11 何江，尚芳红，李隆云，等.佛手指纹图谱的建立及抗氧化谱效关系研究［J］.中草药，2023，54（23）： 7 841.
    HE Jiang，SHANG Fanghong，LI Longyun，et al. Establishment of fingerprints and spectrum-effect relationship of antioxidant activity of Citri Sarcodactylis Fructus［J］. Chinese Traditional and Herbal Drugs，2023，54（23）： 7 841.

12 冯健，李文兵，吴文辉，等.香橼配方颗粒特征图谱研究［J］.中医药导报，2017，23（9）： 56.
    FENG Jian，LI Wenbing，WU Wenhui，et al. HPLC characteristic chromatograms of Citron Dispensing Granules［J］. Guiding Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy，2017，23（9）： 56.

13 毛淑杰，李先端，顾雪竹，等.香橼的质量评价标准研究［J］.中国中医药信息杂志，2008（S1）： 42.
    MAO Shujie，LI Xianrui，GU Xuezhu，et al. Study on quality standards of Citrus Medica［J］. Chinese Journal of Information on Traditional Chinese Medicine，2008（S1）： 42.

14 吴笛，蔺晓源，刘凯，等.高效液相色谱指纹图谱结合多元数据分析用于佛手与枸橼的鉴别［J］.中国药学杂志，2024，59（16）： 1 504.
    WU Di，LIN Xiaoyuan，LIU Kai，et al. Identification of Citri Sarcodactylis Fructus and Citri Fructus based on HPLC fingerprint coupled with multivariate data analysis［J］. Chinese Pharmaceutical Journal，2024，59（16）： 1 504.

15 刘航秀，冯迪，龙春瑞，等.枸橼药用植物果实变异及地理分布研究［J］.中国中药杂志，2021，46（23）： 6 289.
    LIU Hangxiu，FENG Di，LONG Chunrui，et al. Fruit variation and geographical distribution of citron［J］. China Journal of Chinese Materia Medica，2021，46（23）： 6 289.