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嘉峪检测网 2025-08-27 22:03
摘 要: 建立超高效液相色谱-串联质谱法测定猪肉、鸡肉、鱼肉等动物源性食品中残留地西泮。样品经氢氧化钠溶液及乙腈提取,提取液氮气吹干至残渣,用0.1 mol/L盐酸溶液复溶,复溶液经MCX固相萃取小柱净化,5%氨化甲醇洗脱吹干,以乙腈定容溶解,使用电喷雾离子源、正离子扫描方式和多反应监测模式进行测定,内标法进行定量。地西泮质量浓度在0.5~20.0 μg/L内地西泮和内标物的质量浓度比值与地西泮和内标物的色谱峰面积比值线性关系良好,相关系数均大于0.999,检出限为0.5 μg/kg,定量限为1 μg/kg,加标回收率为86.3%~101.2%,测定结果的相对标准偏差为4.08%~10.21%(n=6)。该方法准确度高、灵敏度高、稳定性好,可以同时有效地处理和测定动物源性食品中地西泮的含量。
关键词: 超高效液相色谱-串联质谱法; 地西泮; 动物源性; 食品
地西泮是一种苯二氮卓类镇静剂[1],具有抗焦虑、抗惊厥、镇静、催眠等效果,常用于治疗抑郁、焦虑、暴躁等精神类疾病[2‒4]。人体长期摄入地西泮会导致产生依赖性和耐药性,出现嗜睡、头晕、记忆力减退等后遗症[5‒7],但不少经营者仍违规使用地西泮于动物养殖和长途转运过程中,以抑制动物的应激行为,增加摄食量,达到育肥增重和提高存活率的目的[8‒9]。众多国际组织和国家对地西泮的使用和最大残留限量作了限制[10],我国GB 31650—2019《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》规定,地西泮只允许用于治疗,但不得检出。
目前,地西泮的检测方法有酶联免疫法[11]、气相色谱法[12‒13]、高效液相色谱法[14]、气相色谱-串联质谱法[15‒16]和液相色谱-串联质谱法[17‒21]。酶联免疫法因其特异性反应原理易受到干扰,稳定性差且灵敏度低;气相色谱法测定地西泮步骤繁琐费时,样品处理需要衍生,且不易定性;高效液相色谱法的检测灵敏度差,易受杂质干扰,不易定性;气相色谱-串联质谱法样品处理繁琐费,需衍生化操作,耗时较长;液相色谱-串联质谱法具有灵敏度高、特异性强、多重分析能力等优势,可以同时对多个目标物进行定性和定量,如已有文献报道过血浆[15]、水产品[20]、猪肉[21]中地西泮的检测分析方法。然而报道的文献中,液相色谱-串联质谱法在检测地西泮残留时的样品分类和处理较为复杂,存在不同基质样品处理方法不同的问题。笔者尝试建立一种统一检测方法,简化样品处理程序,适用于不同动物源性食品中地西泮残留的检测方法,旨在为猪肉、鸡肉、鱼肉等样品大批量检测提供参考依据。
1 实验部分
1.1 主要仪器与试剂
液相色谱-串联质谱仪:ACQUITY TQD型,美国沃特世公司。
高效液相色谱仪:e2695型,美国沃特世公司。
电子天平:SQP型,感量为0.1 mg,德国赛多利斯公司。
高速冷冻离心机:Multifuge X1R型,美国赛默飞公司。
氮吹仪:N-EVAP-24型,美国奥格曼公司。振荡器:MS3 basic型,德国艾卡公司。
24位固相萃取装置:W-SPE24型,北京莱伯泰仪器股份有限公司。
乙腈、甲醇:均为色谱纯,德国默克公司。甲酸:色谱纯,美国迈瑞达公司。
氢氧化钠、盐酸、氨水:均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司。
地西泮、地西泮-D5标准溶液:质量浓度均为100 mg/L,坛墨质检科技股份有限公司。
MCX固相萃取柱、HLB固相萃取柱:均为3 mL/60 mg,美国沃特世公司。
C18固相萃取柱:3 mL/100 mg,美国安捷伦科技有限公司。
动物源性食品:采集猪肉、鸡肉、鱼肉样品,取可食肌肉组织部分,高速绞碎均质,-18 ℃下保存,备用。
实验用水为屈臣氏纯净水。
1.2 仪器工作条件
1.2.1 色谱仪色
谱柱:ACQUITY UPLC BEH C18柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm,美国沃特世公司);柱温:35 ℃;进样体积:5 μL;流动相:A相为体积分数0.1%的甲酸乙腈溶液,B相为体积分数0.1%的甲酸水溶液;流量:0.2 mL/min;洗脱方式:梯度洗脱,洗脱程序见表1。
表1 梯度洗脱程序
Tab. 1 Gradient elution procedure
1.2.2 质谱仪
离子源:电喷雾离子源(ESI+);离子源温度:140 ℃;毛细管电压:3.2 kV;脱溶剂气温度:400 ℃;脱溶剂气流量:600 L/h;碰撞气流量:0.15 mL/min;锥孔气流量:50 L/h;监测方式:多反应监测(MRM)。地西泮和内标物地西泮-D5的MRM质谱参数见表2。
表2 地西泮及地西泮-D5的MRM质谱参数表
Tab. 2 MRM mass spectrum parameters of diazepam and diazepan-D5
注:*为定量离子。
1.3 试剂配制
氢氧化钠溶液:1 mol/L。准确称取40 g氢氧化钠,用水溶解并冷却后,转移至1 000 mL容量瓶中,用水定容至标线。盐酸溶液:0.1 mol/L。量取8.3 mL浓盐酸,用水稀释至1 000 mL。5%氨化甲醇:取氨水5 mL,用甲醇稀释至100 mL。
1.4 标准溶液配制
准确移取地西泮标准溶液1 mL至10 mL容量瓶中,用乙腈定容至标线,得到质量浓度为10 mg/L的地西泮标准储备液。量取1 mL地西泮标准储备液至100 mL容量瓶中,用0.1%甲酸乙腈溶液定容至标线,得到质量浓度为100 μg/L的地西泮标准中间液。按同样的方法配制地西泮-D5质量浓度为100 μg/L的内标工作液。置于4 ℃避光保存。
分别吸取地西泮标准中间液0.05、0.10、0.20、0.5、1.0、2.0 mL于6只10 mL容量瓶中,分别加入0.5 mL内标工作液,用乙腈定容至标线,配制成质量浓度分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10、20 ng/mL的系列地西泮标准工作液,其中内标质量浓度为5 ng/mL,现配现用。
1.5 实验步骤
分别准确称取猪肉、鸡肉、鱼肉样品各2 g (精确至0.05 g),置于不同50 mL聚乙烯离心管中,加入50 μL内标工作液,然后加入1 mol/L氢氧化钠溶液0.2 mL和乙腈10 mL,高速涡旋60 s,以8 000 r/min离心5 min,转移上层提取液至50 mL聚乙烯管中。重复提取一次,合并两次提取液,用40 ℃氮气吹至近干。加入0.1 mol/L盐酸溶液3 mL溶解残渣,以8 000 r/min离心5 min,得到猪肉、鸡肉、鱼肉样品提取液。
依次用甲醇、水、0.1 mol/L盐酸溶液各3 mL活化MCX固相萃取小柱,取样品提取液过柱,依次用水、甲醇各3 mL淋洗,抽干,用5%氨化甲醇溶液5 mL洗脱,收集洗脱液,洗脱液在40 ℃氮气吹干。残留物中加入0.1%甲酸乙腈1 mL,充分溶解,过0.22 μm微孔滤膜,供液相色谱-串联质谱仪测定。
在相同的仪器工作条件下,以保留时间和相对离子丰度定性。建立以目标化合物质量浓度为横坐标和目标化合物与内标物的色谱峰面积比值为纵坐标的线性方程来计算样品中化合物的浓度。
2 结果与讨论
2.1 样品处理方法的优化
2.1.1 提取溶剂的选择
目标物地西泮呈弱碱性,根据文献报道,多采用甲醇、乙腈、乙酸乙酯和正己烷等作为提取溶剂[17‒21]。分别采用甲醇、乙腈、乙酸乙酯和正己烷4种提取试剂,按照样品处理步骤对猪肉、鸡肉、鱼肉空白添加样品(5 μg/kg)进行提取,不经净化直接用1 mL 0.1%甲酸乙腈溶液溶解定容,用高效液相色谱仪测定。不同提取试剂时不同样品的回收率见图1。由图1可见,采用乙腈作为提取试剂效果最好。
图1 不同提取剂时3种基质样品回收率(n=3)
Fig. 1 Recovery rates of three matrix samples with different extractants(n=3)
因该步骤未进行净化处理,杂质较多,选择以高效液相色谱仪测定加标样品,以色谱峰高定量,计算回收率。研究发现,甲醇极性强,提取杂质较多,对地西泮的提取效果不理想。正己烷作为提取溶剂时,地西泮的提取效率均偏低,且提取溶液中油脂含量较高,不利于后续的萃取柱净化。使用乙酸乙酯和乙腈为提取溶剂时,二者提取效率相近,但是乙酸乙酯对于高脂肪样品(猪肉)会出现提取溶液中油脂较多的问题,严重影响萃取净化过柱,因此,采用乙腈作为提取溶剂。比较了不同pH值的乙腈提取液对地西泮回收率的影响,结果见图2。由图2可见,不同酸碱度的乙腈提取液对3种样品中地西泮的回收率影响较小,使用经氢氧化钠溶液调节pH值至10左右的乙腈(等同加入1 mol/L氢氧化钠溶液0.2 mL),地西泮的回收率最高。
图2 不同pH值乙腈提取剂时3种基质样品回收率(n=3)
Fig. 2 Recovery rates of three matrix samples with different pH value of acetonitrile extraction agent (n=3)
2.1.2 净化小柱的选择
固相萃取小柱因其操作简单、高效的富集和净化特点被广泛运用于兽药残留检测工作[22‒23]。比较了动物性样品兽药残留检测中常用到的3种固相萃取小柱MCX、HLB和C18对地西泮的净化效果。空白样品猪肉、鸡肉、鱼肉按1.5方法进行处理,获得未净化的空白样品基质提取液,加入100 μg/L的地西泮标准中间液,得到标准添加溶解液。分别使用上述3种固相萃取小柱,按照样品净化步骤对标准添加溶解液进行净化,供超高效液相色谱-串联质谱法测定,采用外标法定量,以回收率评价固相萃取小柱的净化效果,结果如图3所示。由图3可见,HLB小柱对3种样品基质中地西泮的回收率明显低于MCX和C18小柱,说明HLB柱对地西泮的提取净化效果不如MCX和C18小柱。C18小柱对3种样品基质中地西泮的回收率为75.1%~81.9%,可满足检测要求,但不易除去油脂等杂质,试验过程中有明显的柱子堵塞现象。MCX小柱对3种样品基质中地西泮具有良好的净化效果,回收率为86.6%~93.7%,完全满足不同基质样品中地西泮的处理净化要求,因此选择采用MCX柱进行样品净化。
图3 不同萃取小柱时3种基质样品的回收率(n=3)
Fig. 3 Recovery rate of three matrix samples in different extraction columns(n=3)
2.2 基质效应
由于动物产品样品基质组成复杂,容易影响目标物的电离,会产生一定的基质效应[24]。分别选取猪肉、鸡肉、鱼肉3种空白基质样品,按1.5方法制得基质溶液,以基质溶液配制基质标准溶液,供超高效液相色谱-串联质谱法测定,绘制基质标准溶液曲线。基质样品的标准曲线的斜率为ki,溶剂配制的标准曲线的斜率为kn,(ki/kn-1)×100%评价地西泮的基质效应(EM)[25‒26]。EM的绝对值越接近为零,说明基质效应越小,反之则基质效应越大。
不同基质样品中地西泮的色谱图见图4。由图4可见,3种不同基质样品经MCX萃取小柱净化后,该试验基质效应的影响较小。试验方法采用添加同位素内标的方式进行定量分析,在实际样品测定中可以进一步减小基质效应的影响。
图4 不同基质样品中地西泮的色谱图(5 μg/L)
Fig. 4 Chromatogram of diazepam in different matrix samples(5 μg/L)
2.3 线性方程、检出限与定量限
按1.5方法制得空白基质液,按1.4方法采用空白基质液加入标准中间液配制一系列浓度基质标准溶液(内标物质量浓度为5 ng/mL)进行测定,地西泮与内标物的色谱峰面积比值为纵坐标y,地西泮与内标物的质量浓度比值为横坐标x,绘制工作曲线。按照信噪比为3和10分别确定为地西泮的检出限和定量限。地西泮的线性方程、相关系数、检出限与定量限见表3。由表3可知,地西伴质量浓度在0.5~20 ng/mL内,地西泮与内标物的质量浓度比值与地西泮与内标物的色谱峰面积比值线性关系良好,相关系数均大于0.999。
表3 地西泮的线性方程、相关系数、检出限及定量限
Tab. 3 Linear equation,correlation coefficient,detection limit and quantification limit of diazepam
2.4 加标回收试验
称取猪肉、鸡肉、鱼肉阴性样品各2 g,分别加入质量浓度100 ng/mL系列标准工作溶液0.02、0.1、0.2 mL,加入100 ng/mL内标工作液0.05 mL,每一个添加水平做6份平行样品。按照1.5实验步骤处理,测定样品中地西伴含量,加标回收试验结果见表4。由表4可知,以上3种基质样品中加标平均回收率为86.3%~101.2%,测定结果的相对标准偏差(RSD)为4.08%~10.21%(n=6),表明该方法对不同基质样品中地西泮的测定具有良好的准确度和精密度,可以满足GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》对回收率和精密度的要求。
表4 加标回收试验结果
Tab. 4 Results of standard addition recovery test
3 结语
建立了液相色谱-串联质谱法测定不同动物源性食品中地西泮残留量,该方法解决了不同基质样品处理方法需分类处理的问题,样品经氢氧化钠-乙腈提取,选用MCX柱净化,同位素内标法定量,该方法准确度高、灵敏度高、稳定性好,样品处理简便,适用于大批量动物源性食品中地西泮的测定,可为药物残留风险监控与监管提供可靠的依据。
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来源:化学分析计量