摘 要： 建立了蒜薹中6种对羟基苯甲酸酯保鲜剂的快速分散固相萃取-气相色谱三重四极杆串联质谱测定方法。对羟基苯甲酸酯经乙腈提取后，采用快速分散固相萃取法对样品进行净化，采用质谱法检测，外标法定量。6种对羟基苯甲酸酯质量浓度在10～200 μg/L内与对应色谱峰面积线性良好，相关系数均大于0.99。6种对羟基苯甲酸酯的检出限为2.61～3.13 μg/kg，定量限为8.70～10.43 μg/kg。样品平均回收率为107.0%～117.4%，测定结果的相对标准偏差为0.8%～9.7%（n=6）。该方法操作简单、快速、准确，适用于蒜薹中对羟基苯甲酸酯保鲜剂的测定。

关键词： 快速分散固相萃取法； 气相色谱-三重四极杆串联质谱法； 蒜薹； 对羟基苯甲酸酯

对羟基苯甲酸酯具有良好的抑菌作用，是一种常用的抗菌防腐保鲜剂，在食品、饮料、化妆品和医药等行业有广泛的应用[1‒2]。与传统的山梨酸及其钠盐、苯甲酸及其钠盐防腐保鲜剂相比，山梨酸和苯甲酸需要在酸性条件下才能有效抑制微生物的生长，其使用有一定的局限性，而对羟基苯甲酸酯类保鲜剂在pH值为4～8内都能起到良好的抑菌作用，抑菌范围广，稳定性好，因此对羟基苯甲酸的防腐效果优于苯甲酸与山梨酸[3]。但有研究表明，接触对羟基苯甲酸酯可干扰人体的内分泌系统，且对人体细胞有一定的毒性，从而对人类健康产生有害后果[4‒6]。

蒜薹是中国人最常食用的蔬菜之一，其生产季节主要集中在5～6月，通过及时贮藏延长供应期，保鲜期可长达8～10个月。蒜薹保鲜技术主要有冷藏法、化学保鲜法、生物保鲜法和气调冷藏法[7]。对羟基苯甲酸酯类化合物可用作蔬菜的化学防腐保鲜剂，GB 2760—2014《食品国家安全标准　食品添加剂使用标准》规定蔬菜中可以使用的对羟基苯甲酸甲酯及其钠盐、对羟基苯甲酸乙酯及其钠盐(以对羟基苯甲酸计)的最大限量为12 mg/kg，日本规定蒜薹中可以使用的对羟基苯甲酸酯(乙酯、丙酯、异丙酯、丁酯、异丁酯)及其钠盐(以对羟基苯甲酸计)的限量为12 mg/kg。目前，对羟基苯甲酸酯测定方法主要有气相色谱法、气相色谱-质谱法、高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法等[8‒10]，研究对象多集中在调味品、水果、水产品、化妆品和医药等领域，对蔬菜基质研究较少。GB 5009.31—2016《食品安全国家标准　食品中对羟基苯甲酸酯类的测定》中规定了针对酱油、醋、饮料及果酱中对羟基苯甲酸酯(甲酯、乙酯、丙酯和丁酯)的气相色谱氢离子火焰(FID)检测方法，但由于色谱法的局限性，容易出现假阳性的情况，而质谱法在定性方面更具有优势。

食品检测的样品处理一般会经过制备、提取、净化、富集、分离等步骤[11]，常见的样品处理技术包括液液萃取、固相萃取法、凝胶色谱法和快速分散固相萃取法等。快速分散固相萃取法采用溶剂对样品进行提取，加入脱水剂使得水相和有机相分层，再加入净化剂去除样品中的有机酸、脂肪、色素等杂质，其操作简单、耗时少，可以在短时间内处理大量样品，有机溶剂使用量少，因此在食品检测中的应用越来越广泛[12‒13]。笔者以蒜薹为研究对象，建立了快速分散固相萃取法-气相色谱-三重四极杆串联质谱法测定对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸丁酯和对羟基苯甲酸异丁酯的方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

气相色谱-串联质谱仪：Agilent7890+7000B型，美国安捷伦科技有限公司。

电子天平：(1)ML204T/02型，感量为0.1 mg；(2)MS205DU，感量为0.01 mg，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。

离心机：Sigma 3K15型，德国Sigma公司。

组织研磨机：SPEX GENO2010型，美国SPEX SamplePrep公司。

乙腈：色谱纯，美国霍尼韦尔国际公司。

QuEChERS萃取盐包：部件号为5982-7650，美国安捷伦科技有限公司。

QuEChERS净化管：部件号为5982-5356CH，美国安捷伦科技有限公司。

对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸异丁酯标准物质：质量分数分别为99.25%、99.53%、99.06%、99.6%、99.76%、99.8%，德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 气相色谱仪

色谱柱：HP-5MS毛细管柱 (30 m×0.25 mm，250 μm，美国安捷伦科技有限公司)；进样口温度：280 ℃；载气：氦气；流量：1.0 mL/min；进样体积：1 μL；进样方式：不分流进样；程序升温条件：起始温度为100 ℃，以5 ℃/min升到150 ℃，保持2 min，再以40 ℃/min升到280 ℃，保持2 min。

1.2.2 质谱仪

离子源温度：280 ℃；四极杆温度：150 ℃；接口温度：280 ℃；电离方式：EI源；碰撞气：高纯氮气；载气：高纯氦气；监测方式：多反应离子监测(MRM)模式。

1.3 溶液配制

标准储备溶液：分别准确称取10.00 mg对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸丁酯和对羟基苯甲酸异丁酯于6只10 mL容量瓶中，用乙腈定容至标线，配制成质量浓度均为1.000 mg/mL的标准储备液。

混合标准溶液：分别准确移取100 μL的各标准储备液于一只100 mL容量瓶中，用乙腈定容至标线，配制成各组分质量浓度均为1.000 mg/L的混合标准溶液。

基质匹配混合标准工作溶液：将蒜薹空白样品与样品相同过程处理，制备空白基质溶液，准确移取一定量的混合标准溶液，用空白基质溶液配制各组分质量浓度均为10.00、20.00、50.00、100.00、200.00 μg/L的基质匹配混合标准工作溶液。

样品溶液：称取10 g (精确至0.01 g)样品于50 mL离心管中，加入10.0 mL乙腈溶液和1颗瓷质子，振荡混匀。加入QuEChERS萃取盐包，剧烈震荡1 min，以9 500 r/min离心5 min。吸取6 mL上清液至QuEChERS净化管中，涡旋混匀1 min，以9 500 r/min离心5 min，吸取上清液，作为样品溶液。

1.4 实验方法

取基质标准曲线溶液和样品溶液，按照1.2仪器工作条件进行测定，根据各组分的色谱峰面积外标法计算对羟基苯甲酸酯的残留量。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的选择

对羟基苯甲酸酯类化合物属于极性中等偏强的化合物。杨飞帆等[14]分别用DB-FFAP、HP-FFAP、HP-INNOWAX、HP-WAX和HP-5MS等不同极性色谱柱对4种对羟基苯甲酸酯类化合物进行测定，吕稳等[15]比较了HP-5MS，HP-FFAP和DB-624 3种极性色谱柱对16种防腐剂的分离情况，结果均表明HP-5MS柱在测定对羟基苯甲酸酯类化合物时分离度和重现性更好，色谱峰形更佳。分别考察了HP-INNOWAX (30 m×0.25 mm，250 μm)和HP-5MS (30 m×0.25 mm，250 μm)两种不同极性毛细管色谱柱对6种对羟基苯甲酸酯类化合物的分离效果，结果表明，使用HP-INNOWAX色谱柱6种对羟基苯甲酸酯类化合物出峰时间较晚，而且对羟基苯甲酸甲酯和异丙酯没有完全分离；HP-5MS色谱柱测定时间短，出峰更快，峰形尖锐对称，能够完全分离6种对羟基苯甲酸酯类化合物，与文献结果一致，因此，选用HP-5MS色谱柱作为分析色谱柱。

2.2 质谱条件优化

对羟基苯甲酸酯是由对羟基苯甲酸与相应醇类酯化形成的，在EI源轰击作用下，其可能的裂解过程如图1所示：脱去醇基碳链(CnH2n+1O—)，形成m/z 121的碎片离子，脱去酯基碳链(CnH2n+1OOC—)，形成m/z 93的碎片离子，烷基取代苯易发生α-碳和β-碳裂解，形成m/z 91的䓬鎓离子，䓬鎓离子进一步裂解，形成m/z 65的碎片离子。

图1   对羟基苯甲酸酯类化合物可能的裂解途径

Fig. 1   Possible cleavage pathways of parabens

采用串联质谱仪对10 mg/L的6种对羟基苯甲酸酯类化合物混合标准溶液进行母离子扫描，设置扫描范围为m/z 20～300，6种对羟基苯甲酸酯类化合物的扫描质谱图如图2所示，选择质荷比丰度高且不易受干扰的离子作为母离子。将选择的母离子进行产物离子扫描，并对其碰撞能量进行优化，结果见表1。优化后的总离子流图如图3所示。

图2   对羟基苯甲酸酯类化合物扫描质谱图

Fig. 2   Scanning mass spectrum of parabens

表1   6种对羟基苯甲酸酯类化合物质谱参数

Tab. 1   Mass spectrum parameters of 6 kinds of parabens

1—对羟基苯甲酸甲酯；2—对羟基苯甲酸乙酯；3—对羟基苯甲酸异丙酯；　4—对羟基苯甲酸丙酯；5—对羟基苯甲酸异丁酯；6—对羟基苯甲酸丁酯

图3　6种对羟基苯甲酸酯类化合物总离子流图

Fig. 3   Total ion flow diagram of 6 kinds of p-hydroxybenzoates

2.3 样品处理条件优化

2.3.1 提取溶剂的选择

快速分散固相萃取法作为蔬菜中农药残留的样品处理方法，广泛使用乙腈和乙酸乙酯等作为提取溶剂。李燕等[16]比较了乙腈和乙酸乙酯作为提取溶剂测定酱油中6种对羟基苯甲酸酯类化合物，结果表明乙酸乙酯与乙腈的提取效果相近，回收率相当。比较了乙酸乙酯、乙腈和1%乙酸溶液-乙腈三种溶剂的提取效果，6种对羟基苯甲酸酯的回收率见图4。由图4可见，3种溶剂的提取效果并无显著性差异。3种溶剂提取净化后的溶液经气相色谱-质谱法测定，经乙腈提取的溶液杂质影响较1%乙酸溶液-乙腈和乙酸乙酯更小(图5)，故选取乙腈作为提取溶剂。

 1—对羟基苯甲酸甲酯；2—对羟基苯甲酸乙酯；3—对羟基苯甲酸异丙酯；4—对羟基苯甲酸丙酯；5—对羟基苯甲酸异丁酯；6—对羟基苯甲酸丁酯

图4　不同提取溶剂的回收率

Fig. 4   Recovery of different extraction solvents

图5   不同溶剂净化效果比较

Fig. 5   Comparison of purification effect of different solvents

2.3.2 QuEChERS净化材料的选择QuEChERS净化材料主要有PSA、C18、石墨化炭黑(GCB)和无水硫酸镁等，通过不同的配比去除不同基质中的干扰杂质，提高灵敏度和回收率。蒜薹中的杂质主要是水分和色素，无水硫酸镁主要是吸收样品中的水分，PSA具有去除样品中色素的作用，GCB可以去除平面结构中的叶绿素，因此选用900 mg MgSO4-150 mg PSA-45 mg GCB的净化材料对蒜薹进行净化处理。

2.4 基质效应

基质效应是目标化合物在样品基质中的响应与其在纯溶剂中的响应相比增大或减小，使得测量结果出现偏差的一种现象，色谱-质谱联用仪的基质效应一般以增强为主[17]。基质效应计算公式为：EM=(A/B-1)×100%，A为基质标准曲线斜率，B为溶剂标准曲线斜率。当EM＞0时，表现为基质增强效应，当EM＜0时，表现为基质抑制效应；|EM|≤20%为弱基质效应，20%＜|EM|≤50%为中等基质效应，|EM|＞50%为强基质效应[18]。蒜薹中6种对羟基苯甲酸酯类化合物的基质效应见表2。由表2可知，6种对羟基苯甲酸酯类化合物均表现为基质增强效应，且为强基质效应，在实际测定时需采用基质标准曲线进行校正。

表2   蒜薹中6种对羟基苯甲酸酯类化合物的基质效应

Tab. 2   Matrix effects of 6 parabens in garlic shoots

2.5 检出限、定量限和线性回归方程

配制6种对羟基苯甲酸酯类化合物质量浓度均为10～200 μg/L的基质匹配混合标准工作溶液，以定量离子对的色谱峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标进行线性回归分析，向空白基质溶液中添加6种对羟基苯甲酸酯类化合物，将信噪比为3时的添加浓度作为检出限，信噪比为10时的添加浓度作为定量限，结果见表3。结果表明，在所测定浓度范围内，标准曲线线性良好，相关系数均大于0.99。

表3   6种对羟基苯甲酸酯类化合物的线性方程、相关系数、检出限、定量限

Tab. 3   Linear regression equation, correlation coefficient, limit of detection and limit of quantitation of 6 parabens

2.6 样品加标回收试验

以空白蒜薹为基质，分别添加10、20、50 μg/kg的质量浓度水平，每个浓度水平重复测定6次，3个浓度水平的平均回收率和测定结果的相对标准偏差(RSD)分别见表4。由表4可知，6种对羟基苯甲酸酯类化合物的加标平均回收率为107.0%～117.4%，RSD为0.8%～9.7%，满足GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范　食品理化检测》的要求。

表4   6种对羟基苯甲酸酯类化合物加标回收试验结果(n=6)

Tab.4   Recovery test results of 6 kinds of p-hydroxybenzoate compounds by standard addition method(n=6)

3 结论

建立了快速分散固相萃取法结合气相色谱三重四极杆串联质谱法测定蒜薹中6种对羟基苯甲酸酯类保鲜剂的残留量。快速分散固相萃取法操作简单，耗时少，气相色谱法串联质谱法定性定量准确度高，精密度好，适用于蒜薹中对羟基苯甲酸酯类化合物残留量的测定。蔬菜水果中添加的保鲜剂种类繁多，包括对羟基苯甲酸酯类、噻苯咪唑、邻苯基苯酚、联苯及农药类等，该方法仅针对蒜薹中的对羟基苯甲酸酯类保鲜剂残留量进行方法开发，其他蔬菜水果基质以及其他类保鲜剂残留量的测定方法仍需更进一步的研究。

参考文献

1 燕群，党翠红，张育.气相色谱法测定食品中4种对羟基苯甲酸酯类含量［J］.现代食品，2022，28（9）： 133.
    YAN Qun，DANG Cuihong，ZHANG Yu. Determination of 4 p-hydroxybenzoic acid esters in food by gas chromatography［J］. Modern Food，2022，28（9）： 133.

2 CHATTERJEE S，ADHIKARY S，BHATTACHARYA S，et al. Parabens as the double-edged sword：Understanding the benefits and potential health risks［J］. Science of the Total Environment，2024，954： 176 547.

3 宁晓盼，姚倩，许忠祥，等.固相萃取-高效液相色谱法测定水产调味品种7种对羟基苯甲酸酯类防腐剂［J］.色谱，2023，41（6）： 516.
    NING Xiaopan，YAO Qian，XU Zhongxiang，et al. Deternination of seven paraben preservatives in aquatic seasoning using solid-phase extractiong coupled with high performance liquid chromatography［J］. Chinese Journal of Chromatography，2023，41（6）： 516.

4 岑建斌，周朗君，方厚托，等.超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱快速测定水果中17种对羟基苯甲酸酯［J］.分析测试学报，2022，41（6）： 843.
    CEN Jianbin，ZHOU Langjun，FANG Houtuo，et al. Rapid determination of seventeen parabens in fruits by ultra performance liquid chromatography-quadrupole electrostatic field orbitrap high-resolution mass spectrometry［J］. Journal of Instrumental Analysis，2022，41（6）： 843.

5 FRANSWAY A F，FRANSWAY P J，BELSITO D V，et al. Paraben toxicology［J］. Dermatitis，2019，30（1）： 32.

6 NASROLLAHI S S，MOOSAVI N S，YAMINI Y. Determination of parabens in different samples using green analytical chemistry approaches since 2015［J］. TrAC Trends in Analytical Chemistry，2023，166： 117 163.

7 翟钰，郝会芳，魏西会，等.蒜薹保鲜剂残留标准化现状分析与建议［J］.现代食品，2023，29（13）： 140.
    ZHAI Yu，HAO Huifang，WEI Xihui，et al. Analysis and suggestions on standardization status of garlic sprout preservative residues［J］. Modern Food，2023，29（13）： 140.

8 刘益锋，邱嘉兴，张朋杰，等. UPLC-Qrbtrap HRMS法同时测定食品接触用纸23种有机抗菌剂［J］.分析测试学报，2022，41（10）： 1 548.
    LIU Yifeng，QIU Jiaxing，ZHANG Pengjie，et al. Simultaneous determination of 23 organic antibacterial agents in food contact paper products by UPLC-Orbitrap HRMS［J］. Journal of Instrumental Analysis，2022，41（10）： 1 548.

9 YANG C J，CHUNG W H，DING W H. Optimization of double-vortex-assisted matrix solid-phase dispersion for the rapid determination of paraben preservative residues in leafy vegetables［J］. RSC Advances，2020，10（58）： 35 557.

10 SONG S Y，ZHANG Z H，ZOU N，et al. Determination of six paraben residues in fresh-cut vegetables using QuEChERS with multi-walled carbon nanotubes and high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］. Food Analytical Methods，2017，10（12）： 3 972.

11 陈勇，毛永琼，薛雨琴，等.农药残留QuEChERS前处理方法研究进展及应用探讨［J］.食品安全质量检测学报，2024，15（9）： 111.
    CHEN Yong，MAO Yongqiong，XUE Yuqin，et al. Research progress and application of QuEChERS pretreatment method for pesticide residues［J］. Journal of Food Safety & Quality，2024，15（9）： 111.

12 王红梅，石青，王晨，等.气相色谱-串联质谱法测定中药材中35种农药残留的样品处理方法［J］.化学分析计量，2022，31（3）： 58.
    WANG Hongmei，SHI Qing，WANG Chen，et al. The sample treatment method for determination of 35 pesticide residues in Chinese herbal medicine by gas chromatography-tandem mass spectrometry［J］. Chemical Analysis and Meterage，2022，31（3）： 58.

13 魏宁果，贾亦森，范芳芳，等.基于QuECHERS原则的样品处理技术在动物源性食品兽药残留分析中的应用［J］.化学分析计量，2024，33（9）： 124.
    WEI Ningguo，JIA Yisen，FAN Fangfang，et al. Application of sample pretreatment technology based on QuEChERS principles in the analysis of veterinary drug residues of animal-derived food［J］. Chemical analysis and Meterage，2024，33（9）： 124.

14 杨飞帆，赵舒景.气相色谱法测定酱油中对羟基苯甲酸酯类的含量［J］.现代食品，2022，28（10）： 219.
    YANG Feifan，ZHAO Shujing. Determination of p-hydroxybenzoate esters in soy sauce by gas chromatography［J］. Modern Food，2022，28（10）： 219.

15 吕稳，张静雅，胡贝，刘红，黄伟.气相色谱-质谱法测定化妆品种苯甲酸酯类和对羟基苯甲酸酯类16种防腐剂［J］.日用化学工业（中英文），2023，52（2）： 239.
    LYU Wen，ZHANG Jingya，HU Bei，et al. Determination of 16 preservatives of benzoates and parabens in cosmetics by GC-MS［J］. China Surfactant Detergent&Cosmetics，2023，52（2）： 239.

16 李燕，鲍治成，杨冉冉，等. QuEChERS净化-气相色谱/三重四极杆质谱法测定酱油中6种对羟基苯甲酸酯类［J］.食品与发酵科技，2023，59（4）： 151.
    LI Yan，BAO Zhicheng，YANG Ranran，et al. Determination of 6 parabens in soy sauce by QuEChERS purification GC-MS/MS［J］. Food and Fermentation Science & Technology，2023，59（4）： 151.

17 程志，张蓉，刘韦华，等.气相色谱-串联质谱法快速筛查测定中药材中144种农药残留［J］.色谱，2014，32（1）： 57.
    CHENG Zhi，ZHANG Rong，LIU Weihua，et al. Rapid screening and quantitative analysis of 144 pesticide residues in traditional Chinese medicinal herbs by gas chromatography-tandem mass spectrometry［J］. Chinese Journal of Chromatography，2014，32（1）： 57.

18 蔡振辉.基质效应对芹菜中17种有机磷农药残留检测的影响［J］.农药科学与管理，2021，42（9）： 46.
    CAI Zhenhui. Matrix effect on the determination of 17 organophosphorus pesticide residues in celery［J］. Pesticide Science and Administration，2021，42（9）： 46.