引言
质谱分析是使待分析样本中各组分在离子源中发生电离，生成不同质荷比的带电离子，经加速电场的作用形成离子束并进入质量分析器，再利用电场或磁场使不同质荷比的离子在空间上或时间上分离，或通过过滤的方式，将它们分别聚焦到侦测器而得到质谱图，从而获得质量与浓度(或分压)相关的图谱。液相色谱分析是流动相通过输液泵流经进样阀，与待测样品溶液混合，流经色谱柱，在色谱柱中吸附、分离，最后每一组分分别经过检测器转变为电信号，在色谱工作站上出现相应的样品峰。液相色谱技术、质谱技术作为特异性强、较精准的分析技术已应用于实验室多年;但由于其设备昂贵、自动化水平低、检测周期长及对操作人员专业水平要求高等特点，限制了其在临床常规检测中的广泛使用[1-3]。
近年来，随着液相色谱仪和质谱仪国产化进程的加快，结合了液相色谱的分离能力和质谱的质量分离和检测能力的液质联用(liquid chromatography- tandem mass spectrometry, LC-MS)检测系统陆续上市，成为产品注册申报热点，因其具有分析速度快、灵敏度高、准确度高、特异性强、多指标同时分析等优势，被视为临床小分子检测的“金标准”[4-12]。
但由于液相色谱串联质谱法已开展室间质评的 项目数有限，并且质谱众多项目没有优质化学标准品，各厂家色谱和质谱条件等未标准化，前处理条 件和系统匹配性不同，对同一项目也会产生不同 的参考区间和临床检测结果，测量结果的准确性和 一致性有待加强。表现在注册申报中，企业诉求与 监管要求的差异显得越来越突出，常常会遇到临床 使用过程中医学实验室自建检测项目(laboratory developed tests, LDTs)合规性、参考区间确定资料 的规范性、注册单元划分的合理性、临床比对试剂 或比对方法选择的适当性、内标等质量要求与基质 效应验证的充分性、甚至多项目谱系检测在临床预 期使用中的类别等问题[13-18]。
1、 液质联用技术在已上市体外诊断检测的应用概述
经查询国家药品监督管理局数据库，截至2023 年1月28日，已批准注册的液相色谱-串联质谱法产品，国产试剂96个，国产检测仪器10个，进口试剂无，进口检测仪器7个；从被测品种看，以维生素、药物及药物代谢物、免疫抑制剂、激素等检测为主，也包含其他生理、生化或免疫功能指标检测的试剂:如甘胆酸、肌酐、同型半胱氨酸、胆汁酸谱等。预期用途为用于体外定量检测人血清/血浆/血斑等样本中特定被测物的含量，作辅助诊断用。通常，试剂的注册单元包含内标液、流动相、稀释液、质控品、校准品等；也有部分企业申请校准品和质控品单独注册的情形。
2、 LC-MS体外诊断检测产品各国上市前监管要求
2.1 中国上市前监管法规要求
按照原国家食品药品监督管理总局《关于发布医疗器械分类目录的公告》(2017年第104号) 及《体外诊断试剂分类规则》(2021年第129号公告)要求，LC-MS仪器按照第二类医疗器械管理；维生素、药物及药物代谢物、免疫抑制剂、激素等质谱检测试剂按照第二类体外诊断试剂管理; 样本释放剂、样本萃取液、稀释液等通用样本处理液按照第一类体外诊断试剂管理，若为非通用样本处理液或参与反应并影响检验结果的，则与检测试 剂管理类别一致，如内标液，中国食品药品检定研究院(以下简称“中检院”)2020年医疗器械分类界定结果汇总中建议与相应试剂盒组成一个注册单元申请注册。
LC-MS仪器目前尚未纳入《免于进行临床评 价医疗器械目录》，申请人应当按照《医疗器械临 床评价技术指导原则》的要求，结合产品特征、 临床风险、已有临床数据等情形，依据《决策是 否开展医疗器械临床试验技术指导原则》的要求判断申报产品的临床评价路径，包括同品种临床评价路径和/或临床试验路径等。液质联用检测试剂按照《国家药监局关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》(2021年第 122号)要求提交资料，临床部分采用临床评价还是临床试验参照《国家药监局关于发布免于临床试验体外诊断试剂目录的通告》(2021年第70号)执行。在开展临床评价/试验时，对于境内尚无已上市产品可作为比对试剂的情形，申请人可以证明待评价系统与参考测量程序/诊断准确度标准检测结果具有良好的一致性，以证明实质性等同。基于拟研制产品与已上市产品相比，在技术原理、预期用途方面存在实质性差异或者产品临床性能存在根本性改进，在临床诊断应用方面具有明显区别或者产生新的临床应用价值的背景下，LDTs正在推行落地过程中，其具体措施为:针对《医疗器械监督管理条例》中所述“对国内尚无同品种产品上市的体外诊断试剂，符合条件的医疗机构根据本单位的临床需要，可以自行研制，在执业医师指导下在本单位内使用。具体管理办法由国务院药品监督管理部门会同国务院卫生主管部门制定”。2022年12月29 日，国家药监局综合司和国家卫生健康委办公室联合发文《关于开展医疗机构自行研制使用体外诊断试剂试点工作的通知》(药监综械注〔2022〕101 号)，当中明确了试点任务、预计成果及试点自制试剂品种范围。部分液相色谱串联质谱法的体外诊断试剂产品，在试点单位开展了LDTs。
目前，针对液质联用检测技术，国内已有YY/T 1740.1—2021《医用质谱仪第1部分:液相色谱- 质谱联用仪》和YY/T 1870—2023《液相色谱-质谱法测定试剂盒通用要求》正在陆续发布实施过程中，对仪器和试剂的性能做出相应要求。
2.2 FDA上市前监管法规要求
按照FDA的监管要求，质谱仪器及相关配套试剂，属于CFR 21, PART 862。其中质谱仪分类编号为862.2860，按Class I管理，属于510(k)豁免。液相色谱仪分类编号为862.2260，按Class I管理，属于510(k)豁免。但是仪器配套试剂，需要依据产品预期用途再进行分类，例如25-羟基维生素D质谱测试系统分类编号为862.1840，按Class II管理，属于510(k)豁免。
FDA将临床医学检验实验室分成3类：①由食品、药品和化妆品法案管理的体外诊断产品。②分析物特定检测试剂，由生产商提供，没有通过FDA和监管部门批准。③仅用于临床医学检验实验室的LDTs，满足美国临床医学检验实验室改进修正案要求的临床医学检验实验室开展LDTs，多年来一直采用自我管理的模式。尽管FDA监管LDTs的法定资格一直备受争议，但监管机构坚持认为这些测试属于医疗器械并受1976年《医疗器械修正案》管理。起初，LDTs主要用于罕见疾病，并且通常依 赖手动分析和解读。由于LDTs的风险较低，因此免除了适用于其他IVD的更严格的法规要求。近年来，随着技术的进步，LDTs变得越来越复杂，这些技术已经让复杂的分析变得既快捷又实惠。就像经过FDA审查的IVD一样，LDTs对于许多疾病的诊断和治疗都是必不可少的，并且在医学实践中是必不可少的工具。尽管LDTs不断发展，但FDA对其的监督仍然是不足的。
目前，针对质谱检测系统，美国可参考的文件有:“Bioanalytical Method Validation Guidance for Industry”“CAP Chemistry and Toxicology Checklist”“CLSI C50AE mass spectrometry guideline”“CLSI C62-A:Liquid chromatography- mass spectrometry methods”等。
2.3 欧盟上市前监管法规要求
欧盟体外诊断类医疗器械的分类管理主要是基于产品风险的分类规则。仪器配套试剂参照体外诊断医疗器械法规(in vitro diagnostic medical regulation, IVDR)附录VIII的分类规则2.6 rule 6，液相质谱仪器按体外诊断医疗器械法规(IVDR)附录VIII 的分类规则2.5 rule 5中(b)属于Class A。
IVDR中表明了LDTs的概念，相关机构应该保有在本机构内生产、变更、使用器械的权利，以便于当已上市同类产品不能满足某部分目标群体的 特殊要求时发挥作用。只在欧盟卫生机构内部生产且使用的器械，在符合相关条件下可以不受欧盟IVDR监管，但仍需符合相关通用安全和性能要求，尤其对于Class D产品，作出了强调。
2.4 日本上市前监管法规要求
在日本医药品医疗器械法监管体系下，质谱仪、液相色谱仪，如预期用途等明确为临床化学检验仪器，属于质量分析仪，按照Class I管理；如不属于上述情况，需要结合预期用途、检测项目， 根据风险等级判定为Class I(一般医疗器械)、 Class II(管理医疗器械)、Class III、Class IV (高度管理医疗器械)；相关检测试剂，结合预期 用途、检测项目、根据风险等级及对维持生命带来的影响可判定为Class I、Class II、Class III；校准品、质控品等一般为非医疗器械产品。
综上，各国对质谱法配套检测系统的上市前监管 法规要求有差异，部分国家不按照医疗器械管理或管理级别较低。尽管液质联用技术在临床已使用多年，且各国均有LDTs的应用和监管理念，但除FDA对LDTs的实验室有相关准入要求外，其余国家均只给出了LDTs概念，监管细则和监管法规待完善。
3、 上市后临床使用与注册申报常见问题分析
以“液相色谱”“质谱”为关键字，查询到2019年1月1日至今浙江省不良事件报告4份，均为一般事件报告。其中3份“液相色谱串联质谱检测系统”表现为A、B泵漏液、柱前管路堵塞，分别更换密封圈，更换柱前管路后恢复正常;1份“三重四极杆质谱仪”的不良事件报告表现为漏液，定量时质控失控，替换配件后恢复正常。以“Liquid chromatography tandem mass spectrometry”“Liquid chromatography”“mass spectrometry”为关键 字检索美国FDA网站的“Medical Device Reports (MAUDE)”数据库，2019年1月1日至今一共检索到53份报告，其中3份涉及“液相色谱法和串联质谱法”的不良事件报告，均为故障类报告，主要表现为测量结果不正确；14份涉及“检测小分子、维生素和药物免疫抑制剂设备”的报告，表现为测量结果不正确，报告中反映均以“液相色谱串联质谱仪”或“质谱仪”作为测试值数据对照验证，数据有效，与不良事件不相关；34份涉及“检测微生物质谱系统”的报告，表现为结果读数不正确，患者没有临床症状，均为故障类报告；1份表现为“假阴性”的死亡报告，用“质谱法”正确评估验证，与不良事件不相关；1份描述不清无法确定。综上，液质联用质谱技术在体外诊断检测系统中属于较高级方法学的产品，常常用来作相同被测物不同方法学产品测试值的对照验证。
3.1 分类与注册单元问题
液质联用体外诊断检测系统，配套仪器的类别和注册单元较明确;相关试剂产品，注册申报过程中最突出的问题是“内标”的类别及多项联检，校准品、质控品的注册单元。针对“内标”的类别，中检院2020年医疗器械分类界定结果汇总中建议与相应试剂盒组成一个注册单元申请注册，考虑的初衷是其参与反应并影响检验结果。但部分申请者认为，从企业研发和生产的角度讲，大多数内标是作为原材料采购控制，对其稳定性和消除基质干扰能力的验证是在来料检时完成的，且部分省份对其是按照一类医疗器械产品备案的，从产业链上来讲，有专门的内标研发、生产与供应的产业。
多组分检测是液质联用技术的一大优势，因此企业在开发检测试剂时，往往以试剂谱的形式进行开发，如脂溶性维生素、水溶性维生素、胆汁酸谱等。然而在单病种医保支付的背景下，以及检测项目组合形式具备协同诊断意义的原则下，质谱技术的优势与国家宏观政策两者之间如何做合理引导，也是各级审评部门的关注重点。也正是由于多组分检测的便利，临床使用环节，可能会通过多组分组合或比值进行相关疾病的判断，这种新的临床适应证也可能带来试剂类别的问题。
从法规层面上讲，《体外诊断试剂注册与备案管理办法》附则中明确“校准品、质控品可以与配合使用的体外诊断试剂合并申请注册，也可以单独申请注 册”；“医疗器械注册证中‘主要组成成分’栏内所载明的独立试剂组分，用于原注册产品的，可以单独销售”。也就是说，体外诊断试剂配套用校准品和质控品可以单独申报注册也可以与配套的试剂盒作为同 一注册单元注册；作为同一注册单元主要组成成分的 校准品和质控品用于其配套试剂盒时可以单独销售。对于有证产品来说，由于从销售角度讲，试剂盒与校 准品、质控品作为同一注册单元拿证是无障碍的，因 此，生化、免疫、化学发光类产品，非通用或多项的 校准品/质控品，企业通常不再将校准品/质控品单独 注册申报;但由于方法学较新及LDTs等原因，液质配 套试剂存在部分企业对校准品/质控品既单独注册， 又与试剂盒合并注册的情形。
3.2 溯源与一致性问题
新版ISO 17511量值溯源链，底端是由常规方法测定的临床样本结果，顶端的物质是有证一级参考物质，其可用于校准一级参考测量程序，一级参考测量程序可对一级校准品赋值，一级校准品校准参考测量程序，再依次往下是二级参考物质、制造商校准品和常规测量程序等。截至目前，国际检验医学溯源联合委员会公布的70余个血清基质的分析物中，有一半以上的参考测量程序采用ID-MS方法。
目前，已发布的注册检验用体外诊断试剂国家标准品和参考品数量有限，且质谱法检测的是纯物质，因此，部分产品企业溯源至国家药品标准物质。虽然国家卫健委临床检验中心近年来开始开展质谱项目全国范围内的室间质评，但项目数有限，并且质谱众多项目没有商品化的通用质控品，各厂家色谱和质谱条件等未标准化，前处理条件和系统匹配性不同，对同一项目也会产生不同的参考区间和临床检测结果，测量结果的准确性和一致性有待 进一步考量。
3.3 临床评价问题
由于液相色谱-串联质谱检测系统在临床检验中属于较高级的方法学，对于除维生素外的其余被测物，同类已上市产品较少。一方面，从商业竞争 的角度，企业购买竞品困难;另一方面，对于无已 上市同品种的情形，目前临床对外报告采用的就是LDTs，此时，企业能选择的唯一临床评价路径与 监管法规的适用性矛盾就显得尤为突出。
国内，上市前法规要求中LDTs的地位和可接受性尚不明朗，为了符合现行有效的《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》，大多数企业仍然选择2~3家医疗机构开展临床试验工作，因被测标志物临床上暂无“金标准”或质谱法本身就是参考方法，因此对照试验所选择或委托的往往是同一LDTs。若该项目的LDTs有室间质评要求和证书，相对来说可靠性更好一些，但现实中大多数项目，并未开展室间质评工作，此时，对于监管和企业均是巨大的挑战。如何在确保安全有效的前提下扶持新产品上市，成了大系统监管应加快思考落实的焦点。
3.4 性能验证问题
按照国内医疗器械上市前法规要求，除通用/专业标准外，液相色谱-串联质谱检测试剂的性能评估参照《定量检测体外诊断试剂分析性能评估注册审查指导原则》开展。因该指导原则是针对定量检测试剂的通则，针对液质联用检测项目，根据其产品特点和反应原理，内标的稳定性、回收率与基质效应验证的充分性还显得不足；针对多项目谱系检测，常常出现市场上没有所有被测物内标品的提供、同系物共用内标的情形，此时，相关性能验证 工作显得尤为重要。
针对仪器部分，除YY/T 1740.1—2021《医用质谱仪 第1部分:液相色谱-质谱联用仪》规定的评估项目外，离子传输效率、质量范围、质量稳定性、精密度分析，尤其是不同操作者之间的精密度分析等应进一步加强。
4、 监管建议
对于近几年陆续上市的液质联用体外诊断检测系统，由于其属于较高级的方法学，面临临床对照系统难找、商品化的通用质控品未上市、室间质评项目有限、前处理过程各异等亟待解决的问题。站在监管的角度，笔者建议进一步加强对其系统匹配性研究资料、参考区间确定资料的规范性、注册单元划分的合理性、临床比对试剂或比对方法选择的适当性、内标等质量要求与基质效应验证的充分性、甚至多项目谱系检测在临床预期使用中分类的关注。并建议多部门联合，进一步推动LDTs的规范化，在《医疗器械监督管理条例》及药监综械注〔2022〕101号文的基础上，加快实施细则的落地，扩充室间质评项目;作为新技术新产品的必经之路，将其研究数据纳入临床证据的范畴，并加快真实世界数据用于上市前注册的落地工作。而对于企业方，应进一步加强对自身产品的临床性能研究与验证工作，加快内标、真实临床样本基质的质控品、自动化前处理系统、真实世界数据研究等工作，为推动参考区间和临床检验的一致性发挥各自应有的作用。
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【文章来源】中国医疗器械杂志监管与监测 2023 年 47 卷 第 6 期
