在药品生产的每道工序完成后，对设备进行清洗是防止药品污染和交叉污染的必要手段，清洁的效果通常通过清洁验证来评估，而清洁验证效果评估则需要选用一个合适的清洁分析方法来直观反映。常用的清洁分析方法有HPLC、TOC、UV等，本文和大家聊一聊清洁分析方法（HPLC法）验证的关键点，或可供参考。

 

1.清洁分析方法验证主要包括哪些内容呢？

 

清洁分析方法验证主要包括了两部分内容：

1.1对色谱分析方法验证，通常包括专属性、精密度、准确度、线性和范围、定量限、检测限、溶液稳定性。

 

1.2对采用的取样方法的有效性和重现性进行的验证，也就是我们常说的取样效率或者取样回收率。这个过程实际上是一个综合选择的验证过程，包括了选择合适的棉签、选择合适的擦拭溶剂、取样人员如何操作、用棉签取样后用什么方式将残留物提取出来，用什么样的分析方法去分析样品的全面考察。

 

2.方法验证前准备工作中的关键点

 

2.1人员：选择认真、悟性好、执行力强，最好熟悉分析方法验证法规和流程的人员。

 

2.2验证方案

 

（1）验证方案要写得详细，专业又通俗易懂

 

（2）一定要对方案内容、验证中的注意事项进行培训

 

（3）验证实施人员能够正确理解方案，才能正确执行方案

 

2.3验证物品

 

2.3.1对照品：最好用法定对照品，除非无法定对照品

2.3.2棉签：

（1）能被擦拭溶剂很好的湿润（很关键，关系到能否有效擦拭）

 

（2）有一定的机械强度和韧性，足以对设备表面施加一定的压力和摩擦力，并不易脱落纤维

 

（3）与擦拭/萃取溶剂相互兼容，对检测无干扰

 

（4）质优价量（一定要考虑公司成本）

 

（5）棉签杆长度合适，便于折断

 

（6）提示：经过清洁分析方法验证选定合适的棉签后，尽量固定生产厂家，用于后续的清洁验证取样。有效避免空白棉签溶液中的棉签导致的色谱峰大小不或位置不一的情况。

 

2.3.3取样试管：

（1）清洁（非常重要，避免外来污染影响考察结果）

 

（2）干燥、具塞

 

（3）高度合适（与棉签的长度匹配，便于取、放棉签）

 

2.3.4涂布板：（因是模拟取样，所以材质一定要与车间设备一致，最好有匹配的材质证明）

 

（1）口服制剂常用材质不锈钢316等；

 

（2）原料药除了不锈钢之外，还有搪玻璃、聚四氟乙烯等材质；

 

（3）涂布板表面要平整、光滑、干净。

 

2.3.5色谱柱、玻璃量器、仪器等：

（1）合适的色谱柱（填料、规格等），如果对于色谱柱无特殊要求，最好使用两个不同品牌的色谱柱（考虑性能、成本和易于购买、持久供货等）

 

（2）玻璃量器：经过校准，且在有效期内

 

（3）HPLC等：经过校准/确认，且在有效期内

 

3.各项目验证过程中的关键点

 

前面说过清洁分析方法验证实际包括了对分析方法的验证，还有对于取样方法和效果的验证，老王分享过一篇《一文秒懂“清洁分析方法验证中擦拭回收试验”》，其中对于取样方法和效果的验证有详细的描述，本文不再赘述。本文中重点聊一聊清洁分析方法验证中针对分析方法板块的验证关键点。

 

3.1专属性：

 

3.1.1溶液制备：通常制备4种溶液进样，空白溶剂、空白棉签溶液、对照品溶液、棉签擦拭供试品溶液(100%)（模拟从车间取样后的供试品溶液）。

3.1.2专属性考察可接受标准：

（1）空白溶剂在待测物的保留时间处无显著色谱峰干扰；

 

（2）空白棉签溶液在待测物的保留时间处无显著色谱峰干扰（如有，小于LOD也可接受. 同时建议排查是否为残留或实验室污染导致）

 

（3）供试品溶液中待测物的保留时间与对照品溶液中待测物的保留时间一致。

 

3.1.3专属性中常见问题及处理

（1）空白溶剂中有API峰，干扰检测。

对于此种情况，主要的原因可能是实验过程中污染导致，可在实验室将制备空白溶剂、空白棉签的溶剂、盛放溶剂的烧杯等单独区域放置与配制（也就是不要和对照品、供试品溶液在一个区域，不要用相同的烧杯、同一杯溶剂、同一个滴管等）防止交叉污染。

（2）空白棉签溶液中出现棉签导致的峰，大小不一

对于此种情况，可将棉签提前进行预处理，例如，可以提前将取样棉签放入到水或拟选定的擦拭溶剂中超声、浸泡处理，以除去干扰物。

 

3.2精密度：精密度通常用重复性、中间精密度来表征

 

3.2.1重复性：

通常制备6份100%棉签擦拭的供试品溶液考察，6份结果的RSD≤20.0%；

精密度中供试品溶液制备示例：

取XXXX对照品约17mg，精密称定，置100ml量瓶中，用无水乙醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量10ml，置20ml量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀；精密量取1ml至25ml具塞试管中，取一支空白棉签，捻住棉签杆（注意不要接触棉签头的无纺布部分）将棉签无纺布一端插入具塞试管口中，然后用剪刀剪掉手捻过的棉签杆部分后丢弃，在具塞试管中加入稀释剂9ml，加塞后振摇，超声10分钟，放冷至室温，即得。平行制备6份。

3.2.2中间精密度：

不同人员、不同设备、不同日期（注意并非不同时间），操作同重复性中

3.2.3精密度可接受标准：

（1）分别计算重复性6针和中间精密度6针结果的RSD

 

（2）一定计算12份结果的RSD。

 

3.2.4精密度中注意点：

（1）重复性由分析员1 做，中间精密度由分析员2 在重复性试验序列走完后的不同日期试验。

 

（2）重复性和中间精密度应该是完全独立的系统，包括对照品溶液制备、流动相制备等。

 

（3）精密度考察用供试品溶液，记得一定要模拟棉签取样后的供试品溶液。

 

3.3准确度：

 

（1）通常制备LOQ至200%之间的溶液（浓度主要考虑可能残留的最小量和最大量），如LOQ，100%、200%.

 

（2）每个浓度平行制备3份

 

（3）计算：回收率、回收率的RSD

 

（4）注意：准确度要模拟棉签供试品的处理过程，具体操作可参照精密度中溶液制备。

 

3.4线性和范围：

 

（1）溶液制备：至少5个浓度，通常涵盖LOQ至限度200%，如LOQ（考虑残留的最小量） 、50%、100%、150%、200%（考虑残留可能的最大量）。

（2）可接受标准：相关系数r≥0.999。

 

3.5定量限

 

（1）常用信噪比法，用对照品溶液稀释至信噪比大于10：1的溶液

 

（2）基线选择注意：选择待测物质附近基线平滑的约0.5-1min的基线即可，6针中的选择时间应该保持一致，并且一定要是连续的6针

 

（3）注意：清洁分析方法验证中LOQ不能超过限度的1/10（常见问题：清洁分析方法验证中定量限大于清洁限度的1/10，可能导致一些残留物无法被定量检出或报告）。

 

内容延伸：验证中可用清洁限度的1/10浓度作为定量限直接考察，节省了不断调试浓度的工作量。在TOC等清洁分析方法中更为实用一些。

 

3.6检测限：

 

（1）可用定量限溶液稀释3倍，得信噪比大于3:1（注意尽量不超过10:1）。X提示：需要注意做出来的检测限的浓度和信噪比一定要与定量限对比，是否为对应关系。

 

（2）检测限通常3针即可，基线选择同定量限

 

3.7溶液稳定性：

 

清洁分析方法验证中的溶液稳定性考察，主要考虑取样后和检测时间中可能的间隔时间，评估贮存条件（（时间、温度、贮存的取样试管等）对于样品稳定性的影响。

（1）对照品溶液：每个时间点新鲜配制对照品溶液，同时将待考察的对照品溶液进样，计算含量（回收率）。

 

（2）供试品溶液：采用100%棉签供试品溶液，在不同考察时间点进样检测。

 

溶液稳定性考察结果示例：

 

 

（1）清洁分析方法的回收率已经做了，为什么还要做擦拭回收率？4、清洁分析方法验证中常见问题

因为这里的回收率针对的是分析方法的回收率，擦拭回收率中除了对分析方法的考察，更多的是对于棉签选择、擦拭方法与方式选择、提取溶剂与方法的选择等一个综合考察过程。所以及时做了方法回收率（准确度），擦拭回收还是要考察的。

（2）做了擦拭回收率，是不是就不用单独做方法回收率了？

对于这个问题，只能说不建议这样做，因为导致擦拭回收率不合格的原因，除了分析方法还有取样方式、擦拭力度和方法、提取溶剂选择不合适等因素，如果你直接做擦拭回收，不做分析方法的回收率（准确度），当擦拭回收率不合格时可能不利于原因分析。

（3）已知清洁工艺中活性成分会发生降解，如何进行清洁分析方法验证？

如果知道活性成分会在清洁工艺中发生降解，则需要在清洁分析方法开发和验证中考虑增加主要的降解产物的控制，活性成分与降解产物加起来不超过清洁限度。

结语：以上内容为日常工作中总结的清洁分析方法验证中的关键点和风险提示，或可供参考。