随着生命科学技术的进步，PCR成为当下“最热”的检测技术之一。许多生物实验室都会进行PCR实验，正确掌握PCR的原理及检测方法对我们的科研将是如虎添翼。

PCR (polymerase chain reaction)聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增技术，在1985年由美国Cetus公司的Kary Mullis首创，可以将微量目的DNA片段扩增一百万倍以上。Kary Mullis本人因此获1993年诺贝尔化学奖。

优点：敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等，广泛应用于微生物学、考古学、 法医学及体育等领域，并已普及到许多普通实验室, 大大简化了传统的分子克隆技术，从而比较容易地 对目的基因进行分析、鉴定。

PCR的原理

用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片段，类似于天然DNA的复制过程。以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5'末端和3'末端互补的寡核苷酸片段为引物， 在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过 程，即可使目的DNA片段得到扩增。

PCR基本反应步骤

扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特易结合，基本反应步骤分三步：

1、变性(Denaturation)：

加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链。

94°C 30〃

2、退火(复性)(Annealling)：

突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度，结构简单的特点，主要的结合发生在模板与引物之间。

55°C 30〃

3.延伸(Extension):

将反应温度调节到酶的最适温度，在DNA聚合 酶、4种dNTPs及镁离子等存在的条件下，以引物的3'端开始，结合单核昔酸，形成与模板链互补的新DNA链。

72°C 1〃

上述3步为一个循环，每经过一个循环，样本 中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25〜40个循环后DNA可扩增106 〜109 倍。

PCR扩增的特异性是由一对寡核苷酸引物所决定的。

反应初期，原来的DNA担负起使模板的作用，随着循环次数的递增，由引物介导延伸的 片段急剧增多而成为主要模板，最终的扩增产物是介于两种引物5'端之间的DNA片段。

PCR的成分和作用

1、缓冲液：

10~50 mM Tris- Cl (pH8.4)

维持Taq酶作用环境的偏碱性

25~50 mM KCl

促进引物退火，＞50 mM会抑制Taq酶的活性。

100μg/ml牛血清白蛋白(BSA)

对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作用，建议使用乙酰化的BSA。明胶、Tween-20、二硫苏糖醇(DTT)也有类似作用。

2、MgCl2:

L5~2e0 mM

Taq酶具有Mg2+依赖性，显著影响反应 的特异性和扩增片段的产量，过量能增加非特异扩增并影响产率，过低则酶活性显著下降。

3、dNTPs :

dATP、dGTP、dCTP、dTTP—底物

0.02 〜0.2 mM

dNTPs可与Mg2+结合，应注意Mg2+浓 度与dNTPs浓度之间的关系，Mg2+浓度比 dNTPs 浓度高 0.2~2.5 mM。

过高：加快反应速度，还可增加碱基的错误掺入率和室验成本。

过低：反应速度下降，可提高实验的精确性。

4、引物(Primer-P):

预扩增核酸片段两端的已知序列，决定特异性。0.2~1 μM

偏高：非特异产物扩增及错配，增加引物之间形成引物二聚体，产量降低。

偏低：产量降低。

5、Taq DNA聚合酶：

耐高热

0.5~5 U/100μL

1U/25~50μL

偏高：引物非特异产物的扩增。

偏低：产物量降低。

6、模板DNA (Template)：

最低102~105 bpDNA片段，实际用量远远 超过此量，用量需在实验中摸索。1~5μL。

过高：非特异产物增加 

过低：产量降低

7、水：

去离子水，补足整个反应体积。

PCR反应条件优化

1、变性温度和时间：

保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成功的关键。

加热90~95°C, 30~60s，再复杂的DNA 分子也可变性为单链。根据模板DNA复杂程度，可以调整变性温度和时间。一般情况下选择90°C 30〃,可使各种复杂的DNA分子完全变性。

温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。

2、复性温度和时间:

PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。

复性温度的选择，可根据引物的长度和G+C含 量确定，长度在15~25 bp之间时，复性温度Tm=4(G+C)+2(A+T)计算得到，一般位于40~600°C，30~60s。

复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。

一般情况下选择55°C 30〃足以使引物与模板 之间完全结合。

3、延伸温度和时间:

一般位于Taq酶最适作用温度70~75°C之间。引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引物与模板的结合，可以缓慢升温到70~75°C。

延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定，<1Kb, 1分钟足够；>1Kb需加长延伸时间，10Kb片段延伸时间可达15分钟。

延伸时间过长可出现非特异扩增，常用72°C 1〃。

4、循环数:

其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。

理论上说20〜25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，20~30次是比较合理的循环次数。循环次数越多，非特异扩增增加。