摘要
目的:为满足基于风险评估的微生物控制体系及药品质量全过程控制的要求,建立更加完善的药品微生物鉴定溯源标准化分子生物学技术体系。方法:总结各国药典中分子生物学标准体系的构成,并分析《中国药典》中收载的分子生物学技术及该技术在药品微生物鉴定溯源中的应用。结果与结论:分子生物学技术是进行药品微生物鉴定溯源的重要标准,不同的分子生物学鉴定方法都有其优势和局限性,需要根据需求选择最合适的方法，以期达到最佳效果。
一、 引言
药品微生物污染是影响产品质量和用药风险的关键因素,会对临床患者尤其是免疫力低下人群造成致命威胁。近年来,安徽华源生物药业“欣弗事件”黑龙江完达山药业“刺五加事件"和“盐酸奥布卡因凝胶污染微生物事件”等因微生物污染导致危害人民健康的事件都提示着药品微生物污染已成为影响药品质量安全的重要因素之一。如今，《药品生产质量管理规范》(Cood Manufacturing Pmcticeof Medical Products,CMP)人用药品技术要求国际协调理事会(The International Council for Harmonisa.tion of Technical Requirements for Pharmaceuticals forHuman Use,ICH)、国际药品认证合作组织( Phama-ceutical Inspection Convention and Pharmaceutical Inspection Co-operation Scheme.PlC/S),美国注射剂协会(Parenteral Dng Association,PDA)等组织和相关法规对药品生产过程的质量控制提出了更高的要求,如 PDA TR13 中建议 A级和B级区城中所有回收的分离菌株应进行物种确认:发生重大产品故障时,如介质溢出、无菌检查阳性或发生其他严重异常事件时,需进行菌株水平的识别。《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)2020 年版微生物鉴定指导原则(通则 9204)中也提出:无菌试验结果阳性、无菌生产模拟工艺(如培养基灌装失败)环境严重异常事件时,对检出的微生物鉴定至少达到种水平,必要时需达到菌株水平。随着国内外药品法规的微生物控制理念由终产品控制向“全生命周期”过程控制转变,需要对药物原料、辅料、中间产品、终产品、制药用水、环境等中检测到的微生物进行鉴定溯源和风险评估。因此对药品中的污染微生物进行“种"水平的准确鉴定是加强药品生产过程控制,提升产品质量,降低用药风险的有效手段,也是药品微生物污染溯源分析的必要要求。
我国的药品微生物检验工作全面开展起始于1973 年,50 年中从无到有逐渐组建了全国的药品微生物检验队伍和检验体系,建立了国家药品卫生标准和药典标准。药品污染事件的发生促使我们认识到全过程控制理念和药品微生物检验能力建设的重要性和必要性。目前，中国药典》在药品微生物鉴定溯源上面临着未形成规范化的技术要求体系,缺少权威、标准化的判定依据的局面,但随着《中国药典》2020年版四部中聚合酶链式反应法(通则1001)、DNA 测序技术指导原则(通则9108)标准核酸序列建立指导原则(通则9109)等标准的收录分子生物学技术成为了药品微生物鉴定湖源的主流技术,也是未来值得在药典标准化方面持续推进和完善的技术领域。《中国药典》2025 年版编制纲要突出强调了将全面完善基于风险评估的微生物控制体系,进一步强化药品质量全过程控制要求，不断护大先进成熟检测技术的应用,持续推进分子生物学检测技术体系建设，指出了我国药品提高质量和医药产业升级的努力方向。
本文概述了药典中分子生物学检测技术体系的构架,介绍了聚合酶链式反应(Polymerase Chain Re.action,PCR),16S核糖体 RNA(16S ribosomal RNAI6S rRNA)测序技术、全基因组测序技术( Whole-genome sequencing,WGS)、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱( Matrix-assisted laser desorption ionizationtime-of-flight mass spectmmetry,MALDL.TOF MS)等技术在药品微生物鉴定溯源中的发展和应用情况。
二、 各国药典分子生物学技术标准体系的构建
目前，各国药典均收载了分子生物学技术用于药品微生物质量控制的相关章节(表1)。我国药典中分子生物学技术标准体系的构建起步较晚,2015 版《中国药典》中药品微生物鉴定方法主要基于形态学，生化反应等表型鉴定方法。但随着 2020年版《中国药典》第一个分子生物学检查方法,聚合酶链式反应法(通则1001)的收载,我国药典已陆续收载了6个分子生物学相关通则标准(表1)。自此我国药典的分子生物学检测技术体系从缺失的状态逐渐走向完善阶段，分子生物学标准体系的完善将为生物负载非无菌药品中不可接受微生物控制和基于风险的药品微生物全过程控制理念的落实提供技术支撑。
三、 分子生物学技术在药品微生物鉴定溯源中的应用
微生物鉴定技术包括表型微生物鉴定技术和基因型微生物鉴定技术，实际应用中根据所需达到的鉴定水平(属、种、菌株)选择相应的鉴定技术，必要时可采用多相分类鉴定技术。表型鉴定方法操作简单,尤其是自动鉴别系统的使用，是微生物的常规鉴定方法，但该方法依赖于培养方式和培养条件等，过程耗时，结果判断较主观。而且,从生产过程中发现的微生物由于受到药品成分、营养不良或暴露于消毒和清洁剂等环境压力中，微生物的表型特征的表达会受到不可预知的影响，导致鉴定结果不准确。分子生物学技术的研究对象是核酸和蛋白质等生物大分子，可以从生物大分子的结构、遗传信息和代谢信息层面对菌株的种属及来源做出判断。因此,基于微生物核酸和蛋白组成的鉴定方法理论上更值得信赖。检测结果更加准确,灵敏度高特异性强,目前已成为国内外药品微生物鉴定的金标准。
3.1 聚合酶链式反应技术
1985 年 PCR 技术的发明催生了分子生物学技术的发展。PCR 技术模拟微生物 DNA 复制过程,在反应管中加人 DNA 模板、DNA 聚合酶、核苷酸、靶向特异性引物和其他试剂,通过变性-退火-延伸三个步骤,使目标 DNA 以指数扩增的方式快速增加至数百万倍。除传统的 PCR 技术之外,实时荧光PCR(Real-tme PCR)核酸等温扩增技术(Isothermanucleic acid amplification technique)、巢式PCR( Nested PCR)、多重 PCR(Multiplex PCR).数字 PCR( Digital PCR)等技术也得到了广泛发展。目前,PCR 技术已被 USP、EP 和 P等多国药典收录,用于药品中动植物源性成分和微生物检测。PCR 技术也是现代分子生物学技术体系中必不可少的关键步骤，可用于二代测序技术的文库构建、酶联免疫反应前置技术、免疫磁珠捕获目标物 、质谱检测目标物等。
3.2 测序技术
3.2.1 16S rRNA测序
细菌的核糖体 RNA(RNA)基因按沉降系数可分为3种,分别为5S、16S 和 23S rRNA 基因。其中,16S rRNA 基因最常用于细菌的物种鉴定。以 16S rRNA 基因系统发育学作为细菌分类依据的原因包括:(i)它存在于所有生物体中，并具有相同的功能:(ii)包含9个可变区(Variable region,V区)和10个保守区Constantregion,C 区),保守区序列反映了物种间的亲缘关系,而可变区序列则能体现物种间的差异:(ii)细菌16S rRNA 基因可包含足够的信息进行鉴定和系统发育分析[。
细菌16SRNA 基因全长约1540 bp，前 500 bp序列变化较大，包含丰富的种属特异性信息,显示出较好的分辨率和多样性。通过16S rRNA前500bp序列和1500bp序列鉴定菌株结果的比较93.7%的样本能得到相同的鉴定结论。因此，一般仅需扩增前 500 bp 序列，或使用高信息量的可变区(如 V1-V3)也足以满足日常鉴定需求。当然，不同的可变区在识别特定细菌的分类上也可能显示出不同的偏好，如 V1-V2 区和 V3-V5 区分别对变形杆菌门和放线菌门进行分类时效果不佳。在属水平上，V6-V9 区是梭菌属和葡萄球菌属分类的最佳区域。V3-V5 区对克雷伯菌属鉴定效果好，V1-V3 区对埃希氏菌属/志贺菌属能给出较好的鉴定结果，V4区鉴定能力最差。当以 99%相似性进行 OTU 聚类分析时，V1-V9 和 V1-V3 区域可有效反映“种”水平变异。
在测序结果判定方面，获得的核酸序列需要与仪器专用数据库或公共数据库中已知的核酸序列进行比对分析,核酸同源性>98.65%可判定为同一菌种。参比序列大多来源于 NCBI、EMBL、DDBJ.SILVA、GreenGenes、RBD 等数据库，用户通过在线比对分析后，依据核酸相似度判定结果。公共数据库中的序列由提交者上传，数据信息未经过严格审核。当使用公共数据库序列比对时,数据质量不佳或分类注释不准确极有可能导致鉴定结果错误。因此,在序列对比之前需评估数据质量,使用经过验证的数据库或公认的参考数据。
16S rRNA 基因序列分析已成为药品微生物鉴定的金标准方法，被广泛应用于诸如凝固酶阴性葡萄球菌、链霉菌属、芽孢杆菌属等药品微生物的鉴定分析中。但 16S rRNA 鉴定受限于特征核酸序列片段的有限分辨力而无法实现近缘微生物鉴定以及分型溯源,如不能正确识别头葡萄球菌(S. capiis)和木糖葡萄球菌(S. xylosus),因为这两株菌的 16S rRNA 基因序列无显著性差异。因此需要分辨力更高、覆盖范围更广的药品污染微生物鉴定溯源方法。
3.2.2 全基因组测序
全基因组测序是利用高通量测序技术对微生物个体的整个基因组序列进行测定,获取遗传信息的过程。全基因组测序技术主要包括第二代测序技术(又称下一代测序技术，NextGeneration Sequencing,NGS)和基于单细胞测序Single cell genome sequencing)的第三代测序技术全基因组测序可获得微生物完整的遗传信息,包括外显子测序或靶向测序无法获得的核酸信息。随着近年来测序技术的不断进步、测序成本持续降低,使得全基因组测序变得触手可及。
全基因组测序技术的一般流程包括测序样本的获得、测序文库的构建、全基因组测序和数据分析等。全基因组序列数据除了能提供菌株的分类鉴定信息，还可提供菌株毒力因子、耐药性及有毒代谢物产生等特性信息。全基因组测序的平均核苷酸同源性(Average nucleotide identity，ANI)分析可将微生物鉴定至“种”水平，ANI值为 95%被视为界定种的标准。Zhang 等[2]通过计算比较了1226 个细菌菌株全基因组序列间的 ANI值，发现属于同一种的菌株间 AN 为 93.6%,同一属的菌株间 ANI 值为83.6%,而同一科菌株间 ANI为 78.9%。Kim 等通过研究 16S rRNA 基因序列相似性的值和 ANI 值之间的相关性时发现用来区分两个不同种的98.65%的16S rRNA 基因相似性值与 95%~96%的 ANI 值相对应。相比于 16S rRNA 技术，全基因组测序技术由于测序通量较大(Mbp)，在数据分析技术难度、检测成本、参考数据库和标准化等方面均存在较大的挑战。2022 年 11月29 日国家药典委员会发布了“关于微生物全基因组测序技术指导原则草案的公示”该指导原则的制定将规范微生物全基因组测序的方法流程和技术指标，为药品全生命周期质量控制中微生物的精准鉴定、溯源分析和风险识别等提供标准指导。
3.3 MALDITOF MS 法
MALDI-TOF MS 法是基于微生物核糖体等高丰度稳定表达的特征蛋白(相对分子质量2000~20 000)指纹图谱的快速鉴定技术。由于核糖体蛋白具有保守性,一般不会随生长条件的变化而变化,而不同微生物的核糖体蛋白指纹图谱具有各异性,指纹图谱中的某些特征峰具有属、种,甚至亚种特异性,是鉴定细菌和酵母的可靠方法,被认为是替代基因型方法最有前途的技术之一。
MALDI-TOF MS 鉴定微生物的流程主要包括样品准备、质谱测量和数据分析等,通过比较目标样品谱图与己知数据库中的参考谱图的相似性,根据预设的统计学阈值保留最接近的菌种或菌群结果，实现微生物的快速鉴定。因此,使用可靠、经验证的参考数据库是 MALDI-TOF MS 准确鉴定的重要条件之一。当数据库未包含待测菌种分类信息时,可通过自建库方式完善质谱数据库,以提高鉴定的准确率。自建库时,需要对待入库微生物进行详细准确的多项分类鉴定,结合传统生化反应和分子生物学技术确认菌株种属分类,以保证自建库的数据质量。自建库对微生物培养条件、采集图谱数量、模式菌株的选择等均需进行严格的质量控制和有效性验证。
MALDI-TOF MS 已逐渐成为微生物菌种鉴定的标准方法。如中国国家标准委发布的《基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴别微生物方法通则》(GB/T 33682-2017)及美国临床和实验室标准协会(CISI)发布的《Methods for the Identification of Cul-tured Microorganisms Using Matrix-Assisted Laser
Desorption/lonization Time-of-Flight Mass Spectrome.y》,均已将 MALDI-TOF MS 方法的应用标准化和规范化。目前,该方法因成本低、检测速度快、通量高等优势已广泛应用于药品微生物的鉴定。
除了上述讨论的分子生物学技术外,18sRNA/ITS 测序已被广泛应用于药品中真菌的鉴定,而宏基因组技术可在特定环境中对包括细菌、真菌、病毒等全部微生物作为研究对象,可实现对已知和未知微生物的检测,有利于新物种的发现。
四、 结论
分子生物学技术是实现药品生产工艺和生产环境中污染微生物“种”水平准确鉴定的重要技术手段。针对我国药品微生物鉴定领域中共性存在的“缺乏系统的鉴定体系、缺乏权威的判定标尺、缺乏严谨的国家标准”等瓶颈问题,我国药典创新性提出并构建了集“先进鉴定技术+云数据库+国家标准”于一体的药品微生物鉴定多维关键技术及标准体系,有效解决阻碍我国医药产业高质量发展和走向国际的技术壁垒。该体系的建设首先通过对“一代核酸测序、高通量测序、MALDI-TOFMS 技术和微生物质控品”等先进检测技术应用于药品微生物鉴定的技术瓶颈问题开展研究，建立系统、协同应用的药品微生物鉴定关键技术体系，满足精准鉴定、溯源调查以及风险评估等多场景应用需求。其次，针对测序技术和 MALDI-TOFMS 技术应用于药品微生物鉴定,缺乏权威的结果判定标尺、数据库和应用平台问题，研发具有自主知识产权的微生物标准核酸序列及质谱特征蛋白图谱信息“云数据库”有效提升测序和质谱技术数字信息的使用效率,保护国家药品数据安全。最后针对国内外整体缺乏体系化的药品微生物核酸鉴定技术标准,无法保证核酸鉴定技术应用的规范性、科学性和适用性等问题,在国际上率先构建以药典为核心的国家药品微生物核酸鉴定技术通则标准体系,填补相关领域标准空白,体系化引领国际药品微生物核酸鉴定技术标准的发展。中国药典分子生物学技术标准体系的构建包括三个层面:第一层面是建立通用技术要求标准,如通则9108 和通则 9109:第二层面是建立应用于相关领城的检测技术通则标准,如通则 1001、通则 1021 和通则 9204 等:第三层面是将上述标准拓展及应用于标准各论和实际的生产中。这三个层面的标准体系构建和持续推进也符合《中国药典》2025 年版编制纲要的计划和要求。
从微生物鉴定中获得的信息对于调查产品或工艺的污染源非常重要。不同的微生物鉴定方法都有其优势和局限性,需要根据需求选择最合适的方法以期达到最佳效果。伴随成本的降低和分子生物学方法的不断进步,分子生物学技术在药品微生物鉴定源中的应用前景将会更加宽广。未来,分子生物学技术将在药品微生物快速检测技术、多技术联用等方面得到更广泛的应用。目前,聚合酶链式反应和 16S rRNA 测序技术已纳人《中国药典》,其他分子生物学技术的标准化也将对药品微生物的鉴定溯源提供更加全面、准确、可靠的判定结果,为企业的生产环境微生物负载控制和药品的质量控制提供有力的技术保障。《中国药典》分子生物学技术标准体系的持续构建实现了标准化引领,促进了医药产业高质量发展。未来将进一步完善分子生物学技术标准体系,为微生物精准鉴定、溯源分析和风险评估提供强有力的技术手段。
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