卡尔费休法测定水分的方法开发与研究、检测流程优化研究_检测资讯

卡尔费休法测定水分的方法开发与研究、检测流程优化研究

嘉峪检测网 2022-03-17 02:55

水分是重要的质量指标之一，水分含量过高过低都影响着药品食品的品质与质量，无论在质量与经济效益上都起到至关重要的的作用。同样，水分含量高低对微生物的生长及生化反应有着密切的联系，所以水分测定结果至关重要。产品含量结果计算需要水分数据支持，样品水分需要给产品保存运输提供数据支持，一个准确合格的水分值，离不开分析研究人员的基本功检测能力和检测仪器设备支持以及对检测仪器的熟练使用。

中国药典四部收载的水分测定方法有5种，分别为：卡尔费休法、烘干法、减压干燥法、甲苯法、气相色谱法；中国药典一部（中药）水分测定方法主要是烘干法（约占99.2%）、甲苯法（约占0.8%）；药典二部（化学药）水分测定方法基本都是卡尔费休法。从检测成本与耗时经济性考虑，其中卡尔费休法是5种方法中经济和效率性价最高；同样在有明确的检测分析条件与参数，而卡尔费休法（容量法、库伦法）需要研究的项目都较后4种方法要多。

本篇文章主要讲解卡尔费休法，主要涉及原理概述、方法开发与研究、检测流程优化研究与操作规程、故障与问题分析解决。

一、先把原理搞懂！

1、卡尔·费休水分测定法是以甲醇为介质，以卡氏液为滴定液进行样品水分测量的一种方法。此方法操作简单、准确度高，广泛应用于医药、石油、化工、农药、染料、粮食等领域。尤其适用于遇热易被破坏的样品，不仅测出自由水,也可测出结合水。终点判定方法有目测法和电位法两种。

卡尔费休试剂是一种测定某些物质中微量水份用的试剂，其主要成分有：I2 ，SO2 ，C5H5N，CH3OH。卡尔费休法是非水滴定法，所有容器都需干燥；假如卡尔费休试剂在配制和保存过程中若入水，试剂就会失效（超过6g/L含水量）。

2、水分滴定原理：卡尔费休法属碘量法，其基本原理是利用碘氧化二氧化硫时，需要一定量的水参加反应：I2 +SO2 +2H2O→2HI+H2SO4。卡尔费休试剂因含有I2 而显棕色，当I2， SO2 ，H2O反应后，I2 棕色褪去。此法以棕色出现为滴定终点。

上述反应是可逆的。当硫酸浓度达到0.05%以上时，即能发生逆反应。如果我们要想实际让方程按照一个正方向进行，需要往反应体系中加入适当的碱性物质以中和反应过程中生成的酸（氢碘酸、硫酸）。在反应体系中加入吡啶，这样就可使反应正方向（向右）进行。大量实验证明，吡啶是最适宜的试剂，同时吡啶还具有可与碘和二氧化硫结合以降低二者蒸气压的作用。

3C5H5N+H2O+I2+SO2→2HI·吡啶+硫酸酐·吡啶生成硫酸酐吡啶不稳定，能与水发生反应，消耗一部分水而干扰测定，为了体系稳定正常向正方向反应，体系中可加入无水甲醇，反应如：硫酸酐·吡啶+CH3OH（无水）→甲基硫酸·吡啶

3、解决办法：加入甲醇可避免副反应发生，因此，试剂必须加进甲醇或另一种含活泼OH基的溶剂，使硫酸酐吡啶转变成稳定的甲基硫酸氢吡啶。

总反应式：I2+SO2+H2O+3吡啶+CH3OH→2氢碘酸吡啶+甲基硫酸吡啶

二、方法开发研究

卡尔费休方法开发主要内容：信息收集、容量与库伦比较、开发主内容。

（1）API水分检测方法：费休氏-容量滴定法、费休氏-库伦滴定法

（2）中药材水分检测方法：烘干法、甲苯法

（3）制剂水分检测方法

1、信息收集

（1）样品储存方式和样品分类；

（2）首先要确定待测物质的溶解性、理化性质、化学结构、稳定性；

①溶解性：这里的溶解性首先要考虑“脂溶性”，因为费休氏-容量滴定法、费休氏-库伦滴定法、气相色谱法3种方法都要样品溶解处理；

②理化性质：样品是否具有“引湿性或吸湿性” ，样品熔点信息，pH 值等；

③化学结构：具体指水分子在样品中存在形式，如：游离水、结晶水；另外还要确认样品化学结构是否含有其他特殊“醛/酮”结构。

④稳定性具体指热稳定性，是否受热分解。

（3）其次还需要确定样品中是否含有挥发性成分（主要是中药材）。

（4）确认样品实际含水量，确认样品的经济价值，主要用来方法开发作依据。

（5）方法开发原则：样品易灰化的采用卡尔费休法、稳定的采用干燥法。

2、KF容量法与KF库伦法溶剂组成对比（方法关键）

序号

溶剂名称

特点

说明

单组分（容量滴定法）

1）组成：碘、二氧化硫、吡啶（咪唑）、无水甲醇，滴定剂。

2）关键点：价格低，处理简便，滴定度不稳定，滴定速度较慢；可加入助溶剂。

大部分（不含醛酮）；含吡啶与不含吡啶组成常量水分

双组分（容量滴定法）

1）组成：A液-二氧化硫、吡啶的无水甲醇

溶液，作为溶剂；B液-碘的无水甲醇溶液，作为滴定剂。

2）关键点：价格高，使用前按1：1在滴定

杯中进行混合，滴定度稳定，滴定速度快。

醛酮专用

1）组成：碘、二氧化硫、吡啶（咪唑）、乙二醇甲醚，滴定剂。

2）关键点：只适合含醛酮结构样品。

专用试剂

阳极液库伦滴定法

1）组成：碘、二氧化硫、有机碱（吡啶）。

2）关键点：反应快；不需标定，水分准确。

微量水含量≤0.1%水无水合物

（1）含吡啶滴定剂优点：价格低廉及生产工艺简单而仍然广泛应用；含吡啶的卡尔费休试剂比不含吡啶的溶液较稳定，不容易分层，而且有些样品含吡啶的溶解效果会比较好；含吡啶的卡尔费休试剂有利于反应向正方向发生；含吡啶的卡尔-费休试剂终点的突变较明显，反应终点容易判断。（2）含醛酮结构样品：醛(R-CHO)和酮(R-CO-R)与通常的含甲醇试剂反应生成缩醛和缩酮，反应中产生的水同时被滴定，从而导致水分含量升高甚至终点消失。

（3）正常卡尔费休反应的最大速率在5.5到8的pH范围之间，在实际操作过程中应避免pH值小于4和大于8；pH大于8.5时，由于碘和氢氧根或甲基化离子之间的反应，反应速率会增大，但这将导致终点消失，并消耗更多的碘（滴定剂）。

3、水分测定方法的开发与研究

样品成分/处方分析

方法开发前一定要对样品进行处方/成分分析：主要分析样品中是否有与卡尔费休试剂发生副反应；反应不产生水、反应产生水。

与氢碘酸反应产生水的例子：

序号	反应成分	例子
1	NaOH	注射用艾司奥美拉唑钠
2	NaCO3	注射用琥珀氯霉素、注射用硫喷妥钠

氢碘酸能与下述物质反应（无水）：碱、氯、氧气、高锰酸钾、强氧化剂。

主方法选择

（1）方法有：费休容量法、费休库伦法、干燥法、甲苯法。

（2）化学原料药及制剂/化学辅料：通常首选费休容量法，水分检测范围1%-100%，工作效率高检测结构准确度高。

（3）中药材：通常首选干燥法（105℃干燥5小时，恒重5mg），耗时工作效率低。4.含有挥发成分：首选甲苯法（只适合中药材）。

（4）对于含微量水且对水分要求很高、且是无水合物产品，通常首选费休库伦法，水分检测范围0.001%-0.1%。

（5）对于含有结合水/结晶水样品，优先选用费休法（容量法与库伦法）。

（6）根据样品形态性质选用方法：固体样品优选容量法，液体和气体优选库伦法。

KF滴定剂选择

（1）滴定剂有单组分（含吡啶）、双组分、醛酮专用、阳极液

（2）库伦法测定水分首选阳极液。

（3）分析样品结构式，如果样品含有醛酮结构，检测水分首选醛酮专用滴定剂。

（4）一般常用水分检测用，对于含水量低（0.1%≤水分≤0.5%）、且检测准确度要求高，首选单组分（含吡啶）选用几率超过90%，其他一般可选用不含吡啶；其次选择双组分（详见对比表）。

KF方法溶剂选择

（1）溶剂开发原则：

①样品中含游离水，样品不需要完全溶解；样品含有结合水/结构水，样品需要溶解。

②溶剂不能影响样品水分检测，不能与样品有任何反应。

③如果样品不能溶解，可适当添加助溶剂，如甲酰胺、DMF

（2）溶剂有无水甲醇、无水乙醇、无水甲醇- 甲酰胺/DMF。

（3）溶剂首选无水甲醇。

（4）样品含有醛酮结构，检测水分首选无水乙醇作为溶剂。

（5）对于不容易溶解的样品，可配置不同比例浓度的无水甲醇-甲酰胺首混合溶液，比例不要超过60：40（%，V/V），通过实验对比总结（主要是反应终点快慢），经典比例为无水甲醇-甲酰胺=70：35（%，V/V）。

（6）对于样品pH偏高，会引起副反应发生，导致连续反应，而无终点出现或很难达到终点，此时应该加入少许苯甲酸或水杨酸，进行缓和中和一些高碱性环境（不能用乙酸）。

KF方法仪器参数开发选择

（1）转速：经典值 200R/min

（2）水分标定：

起始漂移值（检测前平衡）：20以下漂移值；

终点漂移值（结束）：15-50 漂移值。

（3）样品检测：

起始漂移值（检测前平衡）：30-50以下漂移值；

终点漂移值（结束）：25-60漂移值。

（4）对于样品检测很难达到终点，可将终点漂移值适当提高100。

样品取样量及样品处理研究

（1）对于含水量小于 1.0%大于 0.5% ，样品取样量为 0.2-0.5g；

（2）对于含水量小于 0.5%大于 0. 1% ，样品取样量为 0.5-1.0g；

（3）对于含水量小于 0. 1% ，样品取样量为 1.0-2.0g；

（4）对于样品经济价值高，可根据含水量酌情规定取样量30-50mg，且可根据实际测定情况选用库伦法进行验证或直接选用库伦法（例子：高价值抗肿瘤药）；

（5）对于无水合物样品，可根据含水量酌情规定取样量1.0g-1.5g,如果产品属于高价值产品，可选择低取样量库伦法。

（6）由于样品化学性质导致其 pH 值不同，呈酸碱性，样品处理方法：

①对于酸性样品，样品导致溶剂 pH 值太低或过酸，可选择咪唑作为调节剂；

②对于碱性样品，样品导致溶剂pH值太高或过碱，可选择苯甲酸或水杨酸作为调节剂。

③在方法开发时就应该进行对样品+溶剂的pH值进行研究开发，维持系统pH6.5。

（7）样品取样量：以消耗卡尔试剂2~3ml为标准（F值为3.758mg/ml）。

样品溶解性研究与助溶剂筛选

（1）首先研究在甲醇中的溶解性（费休法溶剂90%以上都是首选无水甲醇系统）。

（2）其次研究在水中的溶解性，主要研究其pKa值（也就是pH值），为确定其滴定系统最优pH环境（pH5.5~7.5）；在实际开发中是否需要添加缓和剂。

（3）研究样品在乙二醇、甲酰胺、DMF、DMSO、二氯甲烷等助溶剂中的溶解性。

（4）助溶剂使用量研究：以刚好溶解为好（能在1分钟内溶解为标准）。

（5）样品吸湿性研究，为样品水分检测流程优化作依据：将溶剂先进行测量水分，再用溶剂进行溶解，将溶液进行一次性注射器转移储存测水分（一次性可以有效避开固体样品称量过程中水分干扰）总水-溶剂水。

检测分析方法验证

（1）专属性：选择1固定结合水样品进行水分检测，分别选用（库伦法、容量法）检查体系专属。

（2）SST：使用纯化水 20mg 进行测定 6 次，计算其 RSD%。

（3）仪器精密度：选择二水合酒石酸钠基准试剂（也可以进行仪器检定）。

（4）精密度：选择开发的样品（含有固定水分），重复检测6次，计算结果RSD%。

（5）准确度：选择开发的样品，分别依次加入不同水分含量（25%、50%、100%），平行测定3次，计算测定结果RSD%。

三、操作注意事项

1.配置要求：干燥器、电子天平（十万分之一）、水分测定仪、除湿机、空调。

2.电子天平、水分测定仪、干燥器要放在同一房间内，且电子天平最好放在水分测定仪的旁边（优先左旁边），干燥器也随样品性质而定，主要优化环境中水分的干扰。

3.不管样品是否有吸湿性，统一转移转存在干燥器中。

4.样品在称量到倒入测量杯中，全程必须有称量舟与水分保护罩一体。

5.仪器开机预热，准备实验用器具材：称量舟、称量勺、微量注射器（50ul）、一次性注射器（2.5ml）、溶剂、滴定剂，并检查系统各个管路接头以及干燥剂。

6.系统置换：

①滴定剂置换/更换并检查系统管路是否有气泡（气密性）；

②滴定杯泵入新鲜溶剂（或无水甲醇），将滴定杯进行除水分预滴定（将测量杯进样口先盖上盖子，注入2/3体积无水甲醇，接着用手轻轻晃动测量杯，直至挂珠消失，准备吸水纸，快速将进样口打开盖子，迅速用吸水纸擦干盖子与进样口内壁的液滴，迅速盖上进样口盖子，并将测量杯内的液体排尽，重新注入新鲜的无水甲醇）。

7.水分标定：穿戴好一次性手套（必须），调出标定模式，进行预平衡，称量 12-15mg纯化水，平衡好快速注入水分（进行减量法），进行标定，标定过程中准备下一份水分，循环平行3次。

8.样品检测：调出测量模式并进行预平衡，用称量舟称取规定量样品，平衡好快速倒入样品（进行减量法），进行测量，记录消耗体积（如果无吸湿性，可在快要结束前30秒开始准备下一个样品）。

9.标定时，水分尽量全部转移或注入滴定杯反应液中，切记注入过力，将液体溅到滴定杯壁上，也避免微量进样针接触滴定液，或进样针接触其他液体或粉末。

10.样品检测过程，尽量不要暴露长时间外面，倒入滴定杯中尽量不要粘在壁上，也就是避免损失和测不到。

11.测定样品水分一定要先水分标定，且水分标定和样品水分测定活动要连贯完成

12.对于易吸水样品，2次平行测定，样品均应在干燥器内拿出进行检测，对于不易吸水的样品可在称量后用保护罩将样品进样器和样品一起套住密封（杜绝外部环境水分入样）。

13.液体样品一定要用滤纸擦干外面的液体，不可存在漏撒样。

14.整个操作过程切勿裸手操作，一定要带上手套进行。

15.查看温湿度表，酌情开空调/除湿机→开机检查/准备→除水操作→标定→检测。

四、故障解决

反应往正方向进行且测定结果快（反应终点快，终点很快终结）、准（终点平衡快），必须保证系统生成的“氢碘酸”不与检品中成分反应。

序号	故障+问题	可能原因	概率（%）	解决办法与措施
1	漂移值太高（滴定前）	系统气密性不好，有水分或湿气不断进入	100%	1.可更换泵入新鲜溶剂进行预滴定，如果还是很高，100%判断气密性。
		进样垫（老化或未拧紧）	20%	更换，或用封口膜进行加保层。
		O形圈（各接口处O形圈）	20%	更换
		分子塞	80%	更换 200-300℃干燥24小时每2个星期更换1次
2	漂移值太高（滴定后）	样品没有完全溶解	50%	增加助溶剂
2	漂移值太高（滴定后）	系统密封	60%	检查密封/更换
3	滴定无法结束	样品影响（pH、反应生成水）	5%	加缓冲液（详见方法开发）
		指示电极污染	20%	清洗（铬酸或硝酸浸泡，水或乙醇浸泡清洗）
		滴定杯密封性查	25%	更换密封盖
4	滴定液管有气泡	泵O形圈（密封O形圈磨损）	100%	1.泵新滴定液进行排 2、更换

5	滴定管有气泡	活塞、滴定密封圈（磨损）	100%	1.泵新滴定液进行排 2.更换 3.使用完进行无水甲醇替换保存（吡啶析晶）
6	结果不平行	称量误差	80%	加大（低水分）称样量
		样品混合不均匀	80%	测量前粉碎混合
		样品损失（洒、粘壁）	85%	流程细化（准、细）

五、小结

方法开发重难点主要体现在：容量法与库伦法选择、溶剂筛选、样品处理、相关计算以及分析方法验收标准；仪器的熟练使用以及检测数据异常分析（包括仪器故障排查与解决）对方法研究至关重要。

水分检测操作关键在于对原理的理解与运用，细化并优化检测流程；熟练掌握仪器使用也是基本。水分检测仪器设备要想运用起来得心应手，就必须要掌握基本理论和仪器设备构造，以及娴熟的操作功底；熟练掌握上述基本功，对我们工作是事半功倍。

来源：实验与分析

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