导读：无论国内药品注册还是国外药品注册，各国药典都是研发过程中必不可少的工具书，众采各家之长，合理制定质量标准。

 

黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO）癌症研究机构划定为一类天然存在的致癌物，是毒性极强的剧毒物质。黄曲霉毒素主要存在于药材、谷物、坚果、棉籽以及动物饲料相关的产品中。当人摄入量大时，可发生急性中毒，出现急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生。当微量持续摄入，可造成慢性中毒，生长障碍，引起纤维性病变，致使纤维组织增生。

 

因此，中国药典对多种中药材都要求做黄曲霉素检查，美国药典对植源性的药品也要求检查黄曲霉毒素。

 

今天我们就详细介绍中国和美国药典的黄曲霉毒素测定方法，供各位参考。

 

中国药典和美国药典中黄曲霉测定方法和限度比较

 

列表如下：

注：总量为黄曲霉毒素B1（AFB1）、黄曲霉毒素B2（AFB2）、黄曲霉毒素G1（AFG1）和黄曲霉毒素G2（AFG2）的总量。

 

各方法的适用范围

 

中国药典的三种方法都可以使用，但当测定结果超出限度时，采用第二法进行确认。

 

而美国药典首先使用第一法，第一法系统适用性不通过才会使用第二法或第三法。

 

美国药典方法介绍

 

由于中国药典较易获得，本文详细介绍美国药典黄曲霉素测定方法。

 

1、第一法（TLC法）

 

该方法用于检测植物来源的材料中可能存在的AFB1、AFB2、AFG1和AFG2。

 

【醋酸锌-氯化铝试剂】取醋酸锌20g、氯化铝5g，加水溶解使成100mL。

 

【氯化钠溶液】取氯化钠5g至50mL水中。

 

【样品溶液1】取植物材料200g，粉碎成细粉，精密称量约50g至带玻璃塞的烧瓶中，加入甲醇-水（17:3）混合液200mL，机械剧烈振荡不少于30min，过滤。（注：如果样品溶液有植物色素干扰，则直接采用【样品溶液2】制备方法。）

 

弃去初滤液50mL，收集续滤液40mL并转移到分液漏斗中，加入氯化钠溶液40mL和溶剂己烷25mL，振摇1min。使各层分离，并将下层水层转移到第二个分液漏斗中，用二氯甲烷提取水层两次，每次25mL并振摇1分钟。每次让各层分离，分离较低的有机层，合并有机层至125mL锥形瓶中。

 

在水浴上蒸发有机溶剂。将剩余提取物转移至合适的样品管中，并在水浴上蒸干。冷却残渣。如果残渣中存在干扰，则按照【样品溶液2】中的方法进行。否则，将上述残渣用氯仿-乙腈（9.8:0.2）0.2 mL溶解，必要时用机械方法摇动。

 

【样品溶液2】取植物材料200g，粉碎成细粉，精密称量约50g至带玻璃塞的烧瓶中，加入甲醇-水（17:3）混合液200mL，机械剧烈振荡不少于30min，过滤。

 

收集滤液100mL，并转移到250毫升烧杯中。加入醋酸锌-氯化铝试剂20mL和水80mL。搅拌并静置5min。

 

加入5 g合适的助滤剂，如硅藻土，混合，过滤。弃去初滤液50mL，收集续滤液40mL并转移到分液漏斗中，加入氯化钠溶液40mL和溶剂己烷25mL，振摇1min。

 

使各层分离，并将下层水层转移到第二个分液漏斗中，用二氯甲烷提取水层两次，每次25mL并振摇1分钟。每次让各层分离，分离较低的有机层，合并有机层至125mL锥形瓶中。

 

在水浴上蒸发有机溶剂。将剩余提取物转移至合适的样品管中，并在水浴上蒸干。冷却残渣。

 

清理程序：在10 mm×300 mm色谱管底部放置一个中等孔隙率的烧结玻璃盘或玻璃棉塞。用乙醚-己烷（3:1）制备2 g硅胶的浆液，将浆液倒入柱中，并用5 mL相同的溶剂洗涤，使吸收剂沉淀，并向柱顶部添加一层1.5 g无水硫酸钠。

 

将上述残渣溶解于二氯甲烷3 mL中，并转移至色谱柱。用1 mL二氯甲烷冲洗烧瓶两次，将冲洗液转移到柱上，以不超过1mL/min的速率洗脱。

 

依次向柱上添加己烷3mL、乙醚3mL和二氯甲烷3mL；以不超过3mL/min的速率洗脱；并弃去洗脱液。

 

向柱中加入二氯甲烷和丙酮（9:1）6 mL，并以不超过1 mL/min的速率洗脱，最好不借助真空。

 

将洗脱液收集在小瓶中，必要时加入沸腾片，并在水浴上蒸干。将残余物用氯仿-乙腈（9.8:0.2）0.2 mL溶解，必要时用机械方法摇动。

 

【样品溶液3】如果残渣仍然有干扰，则直接采用IAC柱清洗程序：将残渣用甲醇-水（6:4）5mL溶解，再加入5mL水稀释，加入到平衡好的IAC柱，用磷酸盐缓冲盐溶液10mL冲洗两次，用甲醇2mL缓慢洗脱，收集洗脱液并用氮气吹干，将残渣用乙腈200µl溶解。

 

【磷酸盐缓冲盐溶液】在水中制备含有0.138 M氯化钠和0.0027 M氯化钾的10 mM磷酸盐缓冲溶液，并用2 M氢氧化钠调节至pH为7.4。

 

【黄曲霉毒素对照溶液】用乙腈制备AFB1、AFB2、AFG1和AFG2分别含有2.0、0.50、2.0和0.50µg/mL的混合对照溶液。

 

首先用乙腈制备标示浓度均为10µg/mL的各储备液，在360nm附近测定最大吸光度，计算公式为：

 

黄曲霉毒素浓度（µg/mL）=（A×Mr×1000）/ε，其中A为吸光度，Mr为分子量，ε为摩尔吸收系数，见下表。

黄曲霉毒素	Mr	溶剂	ε
AFB1	312	乙腈	20700
AFB2	314	乙腈	22500
AFG1	328	乙腈	17600
AFG2	33	乙腈	18900

 

最后，准确量取一定量黄曲霉毒素各储备液至同一容量瓶，用乙腈稀释至规定浓度。冰箱储存，使用前平衡至室温。

 

【黄曲霉毒素溶液】用乙腈稀释黄曲霉素对照溶液，使AFB1、AFB2、AFG1和AFG2分别为0.4、0.1、0.4和0.1µg/mL。

 

【测定方法】分别将黄曲霉毒素溶液2.5、5、7.5和10µL以及3次10µL样品溶液1、样品溶液2或样品溶液3，点样于同一0.25-mm厚度的色谱硅胶TLC板（见色谱法〈621〉）上。并将5µL黄曲霉毒素溶液叠加在三个10µL样品溶液的其中之一上。斑点晾干，用未饱和的氯仿-丙酮-异丙醇（85:10:5）混合溶剂系统展开，展距不少于15cm。取出，标记溶剂前沿，晾干，于365 nm的紫外光下确定斑点。

 

【系统适用性】黄曲霉毒素溶液显四个清晰、分离的蓝色荧光斑点，样品溶液如显斑点，叠加黄曲霉毒素溶液任何斑点的颜色不浅于相应黄曲霉毒素溶液的颜色。

 

【标准】样品溶液不得检出与黄曲霉毒素溶液一致的斑点，如果在样品溶液中检出黄曲霉毒素斑点，需根据样品溶液的荧光斑点位置与黄曲霉毒素溶液中的荧光斑点的位置相匹配，以确定供试品中的黄曲霉毒素类型。如果黄曲霉毒素斑点存在于供试品溶液中，当与黄曲霉毒素溶液中相应黄曲霉毒素的强度进行比较时，将得出供试品溶液中黄曲霉毒素的近似浓度。除非另有说明，则AFB1的限值不得超过5 ppb，AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的总和不得超过20 ppb。

 

2、第二法（薄层扫描法）

 

【氯化钠溶液】取氯化钠5g至50mL水中。

 

【磷酸盐缓冲盐溶液】在水中制备含有0.138 M氯化钠和0.0027 M氯化钾的10 mM磷酸盐缓冲溶液，并用2 M氢氧化钠调节至pH为7.4。

 

【免疫亲和柱IAC】平衡之前需将IAC放至室温，用磷酸盐缓冲盐溶液10 mL以2~3mL/min的速率洗脱，加入样品前需在柱顶端保留0.5mL磷酸盐缓冲盐溶液。

 

【样品溶液】取代表性粉末样品约5g，准确称重，转移至玻璃塞烧瓶中，加入甲醇-水（17:3）20mL，用机械方法用力摇晃30min，过滤。弃去初滤液5mL，收集续滤液4mL。

 

将滤液转移到分液漏斗中，加入氯化钠溶液4mL和己烷2.5mL，摇动1min。使各层分离，并将低层的水层转移至第二个分离漏斗，用二氯甲烷提取水层两次，每次2.5mL，每次摇动1min。

 

使各层分离，合并低层的有机层至50mL锥形瓶中。在水浴上蒸发有机溶剂。将剩余提取物转移至合适的样品管中，水浴上蒸干。冷却残渣。

 

如果残渣中存在干扰，请直接采用IAC柱清理程序，否则，将上述残渣溶解在200µL乙腈中，必要时用机械方法摇动。

 

【IAC柱清洗程序】将残渣用甲醇-水（6:4）5mL溶解，再加入5mL水稀释，加入到平衡好的IAC柱中，用磷酸盐缓冲盐溶液10mL冲洗两次，用甲醇2mL缓慢洗脱，收集洗脱液并用氮气吹干，将残渣用乙腈200µL溶解。

 

【黄曲霉毒素溶液】用乙腈稀释黄曲霉素对照溶液，使AFB1、AFB2、AFG1和AFG2分别为0.04、0.01、0.04和0.01µg/mL。

 

【测定方法】将5、7.5和10µL黄曲霉毒素溶液和3次10µL样品溶液分别点样于合适的200µm厚度的色谱硅胶HPTLC板上（见色谱法〈621〉）。并将5µL黄曲霉毒素溶液叠加在三个10µL样品溶液的其中之一上。

 

斑点晾干，用饱和的氯仿-丙酮-水（140:20:0.3）混合溶剂系统展开，展距不少于72mm。取出，标记溶剂前沿，晾干5min，于365 nm的紫外光下扫描斑点的荧光强度。将供试品溶液的每个荧光点的位置与黄曲霉毒素溶液的荧光点的位置相匹配，以确定存在黄曲霉毒素的类型。样品溶液中黄曲霉毒素的浓度可根据黄曲霉毒素溶液扫描数据得到的标准曲线计算。

 

【系统适用性】黄曲霉毒素溶液显四个明显分离的蓝色荧光点。样品溶液如显斑点，叠加黄曲霉毒素溶液的任何斑点的颜色不浅于相应黄曲霉毒素溶液的颜色。加标AFB1和AFG1的平均回收率不低于70%。

 

【标准】除非另有说明，则AFB1的限值不得超过5 ppb，AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的总和不得超过20 ppb。

 

3、第三法（HPLC-荧光检测器）

 

【0.1M磷酸盐缓冲溶液】取无水磷酸氢二钠（Na2HPO4，分子量141.96）8.69 g、无水磷酸二氢钠（NaH2PO4，分子量119.98）4.66 g或一水合磷酸二氢钠（NaH2PO4·H2O，分子量137.99）5.36 g，溶解于800 mL水中，用2 M氢氧化钠调节至pH 7.4，加入10 mL聚山梨酯20，用水稀释至1 L。

 

【黄曲霉素工作对照溶液】用甲醇-水（1:1）稀释黄曲霉素对照溶液，最终浓度见下表。冰箱保存，使用前平衡至室温，每日新制。

【免疫亲和柱IAC】使用含有对AFB1、AFB2、AFG1和AFG2交叉反应的单克隆抗体的IAC。免疫黄曲霉素柱的总黄曲霉毒素最小容量不低于100 ng。将AFB1、AFB2、AFG1和AFG2每个5 ng，溶于10 mL 10%甲醇的磷酸盐缓冲盐溶液（v/v）中时，各回收率不低于80%。

 

【样品溶液】取代表性的样品5g，置于50mL离心管中，加入氯化钠1 g和甲醇-0.5%碳酸氢钠（7:3）25 mL。在涡流混合器上混合，直到样品颗粒和提取溶剂充分混合。

 

在400 rpm下摇动10min，7000 rpm离心10min，立即用移液管将7 mL移到50 mL离心管中，添加 0.1 M磷酸盐缓冲溶液28 mL，混合，玻璃纤维滤纸过滤，收集25mL滤液（相当于1g样品）到25mL刻度量筒中，并立即进行IAC色谱分析。

 

IAC清理：[注：对于IAC柱在使用前必须在室温下至少保持15分钟。]从色谱柱上取下顶盖，并将其与储液罐连接。从柱上拆下端盖，并将其连接到柱歧管上（必须拧紧）。让柱中的液体通过，直到液体高出柱床约2–3 mm。

 

将25毫升液体倒入储液罐。让液体在重力作用下流过柱子。让柱子流干。

 

为了便于再次开始流动，从歧管上取下色谱柱，向色谱柱中加入约2 mL磷酸盐缓冲盐溶液，将色谱柱重新连接到储液罐上，然后用3mL磷酸盐缓冲盐溶液和5mL水清洗色谱柱（如果能使用其他技术去除色谱柱末端的气泡并很容易重新开始流动，则可将5mL磷酸盐缓冲盐溶液直接添加到色谱柱储液罐中）。

 

让柱子流干，然后用注射器强制注射3mL空气通过柱子。用1mL甲醇洗脱，并用3mL容量瓶收集分析物，使洗脱液自由滴落。让柱子流干。

 

静置1min，然后用额外的1mL甲醇洗脱，并收集在同一容量瓶中。让柱子流干，并强制10mL空气通过柱子。用水稀释洗脱液至刻度，立即进行黄曲霉毒素分析。

 

【系统适用性溶液】向5g样品中加入5mL工作黄曲霉毒素标准溶液5，重复供试品溶液的程序，用20mL代替25mL甲醇-0.5%碳酸氢钠（700:300）的混合物，制备加标样品。

 

【色谱系统】检测器：荧光，激发波长（Ex）362nm，发射波长（Em）440nm；

 

柱：4.6-mm×15 cm；3-µm填料L1；

 

流速：0.8 mL/min；

 

流动相：等度，用PHRED池进行柱后衍生：水、甲醇和乙腈（60:25:15），对于使用Kobra池的柱后衍生：1 L的水-甲醇-乙腈（60:25:15）的混合溶液、350µL 4 M硝酸和120mg溴化钾。

 

柱后衍生PCD体系：PHRED池：柱后光化学衍生池；Kobra池：电化学电池，柱后溴化衍生池。

 

【测定方法】柱后衍生黄曲霉毒素：使用UV或Kobra池。试剂空白（黄曲霉毒素工作对照溶液1），黄曲霉毒素工作对照溶液2~6，或样品溶液各进样50µL，通过比较样品溶液与工作溶液的保留时间，确定试验溶液中的黄曲霉毒素峰。黄曲霉毒素的洗脱顺序为AFG2、AFG1、AFB2和AFB1。通过PHRED或Kobra池后，AFG1和AFB1被衍生化形成AFG2a和AFB2a。

 

使用PHRED电池，AFG2、AFG2a、AFB2、AFB2a的保留时间在14到27min之间；使用Kobra池，保留时间更短。峰值应该是基线解析的。建立每种黄曲霉毒素的标准曲线。根据标准曲线测定样品溶液中每种黄曲霉毒素的浓度。

 

黄曲霉毒素校准曲线：AFB1和AFG1的范围为0.25~4 ng/mL，AFB2和AFG2的范围为0.0625~1 ng/mL。如果样品的响应超出（更高）校准范围，应使用甲醇-水（1:1，v/v）稀释样品溶液，并重新进样。

 

黄曲霉毒素的定量：通过测量每个黄曲霉毒素保留时间的峰面积并将其与相应的校准曲线进行比较来实现的。

 

【系统适用性】添加AFB（2µg/kg）和黄曲霉毒素（5µg/kg）的平均回收率分别为68%和70%。AFB1和黄曲霉毒素总量的相对标准偏差（RSD）不高于10%。

 

【计算】根据浓度（ng/mL，x轴）绘制每种毒素标准品的峰面积（响应，y轴），并确定斜率（S）和y截距（a）。

 

按以下公式计算样品中的毒素含量：

 

毒素（µg/kg）={[（R−a）/S]×V/W}×F

 

R=样品溶液的峰面积；a=校准曲线的y截距；S=校准曲线的斜率；V=样品溶液的最终体积（mL）；W=通过免疫柱的供试品1g；F=稀释系数，V=3 mL时为1；黄曲霉毒素的总量是AFG1、AFG2、AFB1和AFB2的总和。

 

【标准】除非另有说明， AFB1的限值不得超过5 ppb，AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的总和不得超过20 ppb。