在全球生物医药产业高速发展的背景下，蛋白类药物凭借其精准治疗的显著优势，已成为制药领域增长最快的细分赛道。蛋白质药物的稳定性至关重要，直接关系到其疗效、安全性和储存运输。
蛋白质热变性温（Tm）
蛋白质的热变性温度（Tm）是指蛋白质在加热过程中，发生热变性解折叠50%时对应的温度，是量化蛋白质稳定性的关键指标之一。准确测定 Tm值，对于蛋白类药物开发、酶工程改造及理解蛋白-配体相互作用等具有重要的意义。
目前，常用的蛋白质 Tm 值测定方法主要有三种：差示扫描量热法 (DSC)、圆二色光谱法 (CD) 和差示扫描荧光法 (DSF)。DSC是深度热力学解析金标准，尤其适合精确测量变性热力学参数 (ΔH, ΔCp) 的基础研究或关键药物表征；DSF快速、低消耗、高通量的特点，成为早期药物发现、条件筛选 (缓冲液、pH、配体、稳定剂)、突变体库筛选的首选工具；CD则是分析蛋白质高级结构变化的理想选择。
本文重点介绍圆二色光谱法(CD)测定蛋白质热变性温度（Tm），从而分析蛋白类药物二级和三级结构的原理和实践，以飨读者。
圆二色光谱（Circular Dichroism，CD）是通过测量蛋白质分子对左右旋圆偏振光的吸收差异来研究蛋白质结构的技术。蛋白质的二级结构（如α-螺旋、β-折叠等）会导致分子对不同偏振光的吸收不同，这种吸收差异即为圆二色效应。利用远紫外区（190-260nm）的光谱特征能够快速分析出溶液中蛋白质的二级结构以及研究蛋白质的折叠和构象变化。CD通过实时监测蛋白质二级结构在升温过程中的解折叠行为，以特征CD信号的突变为指标，信号发生显著变化的温度区域即对应变性过程，通过拟合可得到 Tm。其优势在于无需标记或染色、灵敏度高，且能直接反映构象变化，是研究蛋白质稳定性的经典方法。
单点变温法
样品先进行190~260 nm的波谱扫描，确定其 CD 信号最高或最低的波长( 即变温实验中变化最显著的波长) ，在该波长下进行变温扫描实时检测。
全波长变温法
样品检测中使用全波长变温法，变温扫描过程中检测整个190~260 nm 波段的变化。
数据使用JASCO自带软件Spectra Manager进行分析。
实验室的圆二色光谱仪为JASCO的J-1500，配备帕尔贴控温设备以及微型水循环，升温速度可调，温控准确度优异，可满足蛋白质热变性等精密实验需求。
案例分析
▉ 蛋白质热变性温度蛋白样品首先优化浓度和温度范围等条件，然后进行热变性实验，根据仪器配套软件进行热变性分析：1）每个波长的变温曲线，2）温度-波长CD三维图，3）计算出热力学参数（Tm值）等。
图1 CD变温扫描曲线
图2 蛋白质热变性温度(Tm)
