使用含SYBR Green I染料的qPCR试剂进行实验后，要对扩增产物做融解曲线分析。
其过程是通过缓慢提高温度，并同步采集反应管内的荧光信号，最终将这一连串连续的数据绘制成一段曲线。
它反映的是管内PCR产物的融化过程——DNA双链不断打开，直到完全没有双链。
所以，随着温度升高，管内的荧光强度会不断下降，因为SYBR Green I染料只在DNA双链中结合并发光。如下图，是融解曲线的原始数据图，Y轴记录的是荧光强度，X轴是温度。
图源：Thermo fisher
可以看到，荧光强度的下降不是匀速的，在某个温度时，荧光强度出现了急剧下降。
因为温度升高到这个点时，PCR产物中有50%的DNA双链发生了解链，这个温度叫Tm值。
这个Tm值非常重要，它完全由DNA序列决定，两段DNA序列，哪怕只有一个碱基的差异，它们的Tm也会不一样。
因此，分析Tm值所对应的荧光信号，可以在一定程度上判断PCR产物是否OK。
设备会将这段原始数据进行处理，使其变成负导数曲线的样子，如下图，突出的"山峰"就是Tm值。
图源：Thermo fisher
通过观察峰的数量和形状，就可以大致知道实验结果好不好。
如果只有一个单峰，说明PCR产物的大小和序列是一致的，在这个基础上，如果峰对应的温度和目标序列的Tm值能匹配上，那这个PCR结果应该就是你的特异性扩增产物。
反之，如果有多于一个峰，则说明有其他无关的扩增产物。常见的有什么呀？
1 引物二聚体，它的序列较短，因此，如果有，那么它的峰会在较低温度对应的位置出现，通常比目的片段的Tm低5-10°C，且因为引物二聚体的长度特别短，所以它的荧光信号也会低，反应出来的峰高度会远远比目的片段的峰要矮。
图源：Researchgate
2 非特异性扩增片段，比如引物设计得不好，结合到模板的2个位置上，这样会扩出了2段序列不同，但都挺长的DNA。那么反映在融解曲线上就会是两个高度相似的峰，且峰对应的温度都比较高。
图源：Researchgate
有时候，看上去像是一个峰，但这个峰特别宽，而且矮，那说明扩增产物里面是一堆长短不一的片段，可能彼此只相差几个、十几个bp。
图源：Researchgate
这说明啥？可能是模板有降解，造成引物能扩出来的片段本身就有多种长度，或者是反应的条件不好，例如退火温度太低，导致引物的非特异性结合。
此外，还有一种常见的问题，就是只有一个峰，但每个复孔的峰它总是合不上，看上去就是峰无法重叠在一起。这个时候，我觉得问题主要是出在实验操作者身上，比如加样不均匀造成不同孔的反应体系不一致，有的孔引物多一点，有的孔模板少一点。
图源：Researchgate
最后，总结一下今天的内容。融解曲线是qPCR实验结束后的一种质控手段，用于分析PCR产物是否单一且符合预期。
看峰怎么看？看峰的数量、形状、对应的温度以及多组样本的峰是否重叠。
