栀子柏皮汤始载于张仲景的《伤寒论》，由栀子、黄柏、甘草三味药材组成，其具有泄热利湿退黄的功效，是治疗湿热黄疸的经典方剂。栀子柏皮汤不仅是退黄三方之一，还具有多种临床疗效，如通过干预机体炎症、调节机体免疫来治疗肝炎和原发性肝癌。
指纹图谱技术可以对中药进行整体性质量控制，将复方中药与药材指纹图谱谱峰进行匹配，也常用于评价中药质量。目前，针对栀子柏皮汤复方中药相关研究主要集中在生物活性、化学成分、本草考证、提取工艺、含量测定、药代动力学等方面，而关于栀子柏皮汤复方中药指纹图谱研究尚未见报道。
研究人员以栀子柏皮汤复方中药为研究对象，建立其高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，指认其特征峰，并与单味药指纹图谱进行匹配，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）开展相似度评价，以期为栀子柏皮汤的质量控制、临床用药提供方法参考。
1试验方法
根据《伤寒论》，确定栀子柏皮汤的制备方法为：分别称取栀子10g、黄柏6g、甘草3g，置于1000mL烧杯中，加水400mL，浸泡30min，武火煎煮至沸腾后，调文火煎煮至250mL，依次用滤纸、0.45μm水相滤膜过滤，即得栀子柏皮汤供试品溶液，按照仪器工作条件进行测定。同法分别配制单味药材（栀子、黄柏、甘草）溶液。2结果与讨论
2.1 分离条件的选择
试验采用二极管阵列检测器（DAD）对栀子柏皮汤供试品溶液进行测定，考察了不同流动相体系 [0.2%（体积分数，下同）磷酸溶液-甲醇、0.2%磷酸溶液-乙腈、0.2%（体积分数，下同）乙酸溶液-甲醇、0.2%乙酸溶液 -乙腈、0.2%甲酸溶液-甲醇、0.2%甲酸溶液-乙腈 ]、柱温（25，30，35℃）、色谱柱 [Diamonsil C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）、ODS-2-Hypersil C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）、Syncronis C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）]等对栀子柏皮汤指纹图谱色谱峰分离效果及出峰数量的影响。结果表明，试验选用 Diamonsil C18色谱柱、柱温35℃时在 250nm波长下以0.2%甲酸溶液-甲醇为流动相体系进行梯度洗脱，得到的基线相对稳定，栀子柏皮汤15个共有峰分离效果较好。
2.2 栀子柏皮汤HPLC指纹图谱的建立
取10批栀子柏皮汤处方药材和各单味药材，按照试验方法进行制备和分析，记录色谱图；取混合标准溶液，按照仪器工作条件进行测定，记录色谱图。将色谱图导入到中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版），以S1样品色谱图为参照指纹图谱，采用中位数法生成对照指纹图谱（R）。10批栀子柏皮汤和单味药材的叠加指纹图谱、对照指纹图谱、混合标准溶液的色谱图见图1。
结果显示，10 批栀子柏皮汤指纹图谱共得到15个共有峰，其中8、11、13号峰归属于黄柏药材的吸收峰，1~7、9、10、12、14、15号峰归属于栀子药材的吸收峰，甘草药材未产生15个共有峰中的吸收峰。在中医处方中，甘草是最常用的一味中药，常用于调和诸药，被誉为“十二经之使”，依据中医药配伍理论，甘草属于“使药”，在处方中主要起调好药性作用，不作为质量控制的关注点。
由于栀子柏皮汤由栀子、黄柏、甘草药材组成，其中含有木兰花碱、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、甘草苷、盐酸小檗碱、甘草次酸、西红花苷 -Ⅰ等化学成分，与对照品比对，指认d、9、10、e、13号峰分别为木兰花碱、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、甘草苷、盐酸小檗碱。由于部分批次峰面积较小或未检测到d号峰和e号峰，因此没有将d号峰和e号峰作为栀子柏皮汤指纹图谱的共有峰，相关研究有待进一步深入。
由于栀子苷峰的保留时间适中、峰面积最大，因此选择10号峰为参照（S）峰。分别计算10批栀子柏皮汤指纹图谱中其余14个共有峰与参照峰的相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差（RSD），结果见表1。
表1 共有峰的相对保留时间和相对峰面积的结果（n=10）
结果显示：14个共有峰的相对保留时间的RSD为0.017%~0.89%，说明仪器稳定性较高；14个共有峰的相对峰面积的RSD为20%~70%，说明栀子柏皮汤在临床用药时，可能受处方药材产地、采收期、提取温度等因素影响，各批次栀子柏皮汤共有峰差异性较大，相对峰面积的RSD呈现一定的波动性。
2.3 相似度评价
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）进行相似度评价，结果见表2。
表2 相似度评价结果
结果显示，10批栀子柏皮汤指纹图谱与对照指纹图谱的相似度为0.880~0.949，表明不同批次间总体差异性较小，但由于受药材产地、采收期等因素的影响，栀子柏皮汤的化学质量存在一定的差异性。
2.4 方法学验证
2.4.1 精密度试验
取栀子柏皮汤处方药材S1，按照试验方法制备供试品溶液，并按照仪器工作条件连续进样6针，以10号峰为参照峰，计算各个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果显示，栀子柏皮汤各个共有峰的相对保留时间的RSD均小于0.30%，相对峰面积的RSD均小于2.8%，表明仪器精密度良好，符合检测要求。
2.4.2 重复性试验
取栀子柏皮汤处方药材S1共6份，按试验方法制备6份供试品溶液并进行测定，以10号峰为参照峰，计算各个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果显示，栀子柏皮汤各个共有峰的相对保留时间的RSD均小于0.060%，相对峰面积的RSD均小于3.0%，表明该方法重复性良好。
2.4.3 稳定性试验
取栀子柏皮汤处方药材S1，按照试验方法制备供试品溶液，于室温放置 0，2，4，6，12，24h后按照仪器工作条件进行测定，以10号峰为参照峰，计算各个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果显示，栀子柏皮汤各个共有峰的相对保留时间的RSD均小于1.0%，相对峰面积的RSD均小于3.0%，表明供试品溶液在室温放置24h内稳定性良好。
3试验结论
研究人员建立了栀子柏皮汤的HPLC指纹图谱，确定了15个共有峰，相似度评价结果表明栀子柏皮汤质量整体稳定；与对照品比对，指认9、10、13号峰分别为京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、盐酸小檗碱。该方法稳定、简便，可为栀子柏皮汤的质量控制、临床用药及后期新药研发提供参考与方法借鉴。
作者：李燕1，滕乐1，唐军相1，张德庆1，李阳2，韩忠耀1
单位：1. 黔南民族医学高等专科学校；2. 驻马店市中心医院。
