摘要

建立了一种高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）测定盐酸氟桂利嗪胶囊中潜在基因毒性杂质氟桂利嗪杂质8。采用Agilent Poroshell120EC C18色谱柱（3.0mm×50mm，2.7µm），乙腈-10mmol/L乙酸铵梯度洗脱，流速0.3mL/min，柱温30℃；电喷雾正离子模式（ESI+），多反应监测（MRM）模式进行定量检测。结果表明，空白溶剂对氟桂利嗪杂质8检测无干扰，3~150ng/mL质量浓度范围内线性良好（r=0.999）。加标回收率85.1%~93.7%，RSD为3.4%，精密度良好，定量限8pg/mL，检测限2pg/mL。采用TTC法对34批不同处方的样品进行检测，均符合规定。本方法灵敏、准确，适用于盐酸氟桂利嗪胶囊中基因毒性杂质8的质量控制，但需关注其同分异构体的潜在风险。

关键词

基因毒性杂质；氟桂利嗪杂质8；高效液相色谱-串联质谱法；TTC法；同分异构体

盐酸氟桂利嗪为一种选择性钙拮抗剂，是唯一能够通过血脑屏障发挥作用的钙离子拮抗剂。可改善脑微循环及神经元代谢，抑制脑血管痉挛、血小板凝聚及血液黏滞度增高等，主要用于典型（有先兆）或非典型（无先兆）偏头痛的预防性治疗及由前庭功能紊乱引起的眩晕的对症治疗[1-3]。常见的不良反应为嗜睡、疲乏、抑郁、上腹痛、体重增加（食欲增加）、肌肉疼痛等，少部分人会出现不自主运动、下颌运动障碍、强直等椎体外系症状[4-6]。

根据结构预测，盐酸氟桂利嗪可能存在潜在基因毒性杂质4-[双（4-氟苯基）甲基]-1-[（3-苯基环氧乙烷-2-基）甲基]哌嗪-1-氧化物（命名：氟桂利嗪杂质8），化学结构式见图1，为盐酸氟桂利嗪在一定反应条件下被空气中的氧气氧化产生的氧化产物。经ADMET Predictor软件预测，该杂质具有基因毒性。基因毒性杂质（Genotoxic Impurities，GTIs）可通过与DNA直接作用，引发碱基错配、断裂或染色体畸变，导致基因突变或癌症风险显著增加，在极低浓度下即可造成不可逆的DNA损伤，氟桂利嗪杂质8含环氧丙烷结构，可能通过烷基化作用损伤DNA。ICH M7、EMA等指南要求对潜在基因毒性杂质进行风险评估与控制，基因毒性杂质通常需控制至ppm甚至ppb级，因此需建立高灵敏度分析方法（如HPLC-MS/MS、GC-MS/MS）对该类杂质进行监测，确保药物安全。

本研究参考相关文献，建立了一种高效液相色谱-串联质谱法，可用于快速检测盐酸氟桂利嗪胶囊可能存在的氟桂利嗪杂质8，为药品安全监管提供技术支撑[7-15]。

1仪器与试药

1.1 仪器

AB Sciex5500三重四极杆质谱仪，上海爱博才思分析仪器贸易有限公司；XP205电子天平，精度0.01mg，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.2 试药

氟桂利嗪杂质8对照品（批号：25-SEP-23-08，纯度：94.94%），QUALITY CONTROL CHEMICALS INC；34批不同企业不同处方的盐酸氟桂利嗪胶囊样品；甲醇、乙腈（色谱纯，4L），默克；甲酸铵（色谱纯，100g），科密欧。

2方法与结果

2.1 色谱与质谱条件

2.1.1 色谱条件

Agilent Poroshell120EC C18色谱柱（3.0mm×50mm，2.7µm）；以乙腈为流动相A，以10mmol/L乙酸铵溶液为流动相B，照表1进行梯度洗脱；流速：0.3mL/min；柱温：30℃。

2.1.2 质谱条件

采用三重四级杆质谱检测器，电喷雾正离子模式（ESI+），进行多反应监测（MRM），气帘气压力为30psi，喷撞气为9psi，离子化电压5500V，干燥气温度500℃，喷雾气压力为50psi；辅助加热气压力为50psi。MRM参数见表2所示。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液

取本品内容物研磨成细粉，精密称取适量（约相当于盐酸氟桂利嗪20mg），置10mL量瓶中，加甲醇适量使溶解，涡旋5min，振摇10min，用甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，过滤，精密量取续滤液5mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，既得。

2.2.2 系列标准溶液

取氟桂利嗪杂质8对照品，用甲醇配制成为浓度分别为3、7.5、20、50、75、100、150ng/mL的系列标准溶液。

2.3 专属性试验

取空白溶液（甲醇）、标准溶液（75ng/mL）、供试品溶液分别注入高效液相色谱-串联质谱仪，照2.1色谱与质谱条件检测，记录色谱图。结果表明，空白溶剂在目标峰位置不出峰，不干扰氟桂利嗪杂质8的测定。在该条件下，标准溶液在7.5min和7.7min出现两个峰且存在动态转化，推测该杂质存在同分异构体。设定Scan Type模式扫描Product Ion（MS2），通过提取离子流色谱图，发现仅7.5min峰存在133.1的碎片离子，推测杂质8存在如图2结构的三元氧环开裂后的同分异构体（氟桂利嗪杂质9）。因标准溶液两个峰存在转化但总峰面积相对稳定，以两峰之和计算相应结果。

2.4 线性和范围

取氟桂利嗪杂质8系列标准溶液，照2.1色谱与质谱条件进样检测，记录峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，建立标准曲线。氟桂利嗪杂质8在3.0076~150.38ng/mL浓度范围内线性回归方程为y=90037x-114196，r=0.999，线性关系良好，符合痕量分析要求。

2.5 定量限和检测限

取氟桂利嗪杂质8系列标准溶液（1）逐步稀释，照2.1色谱与质谱条件进样检测，按S/N=10折算定量限为8pg/mL，按S/N=3折算检测限为2pg/mL，满足基因毒性杂质检测需求。

2.6 回收率试验

回收率溶液的制备：取盐酸氟桂利嗪胶囊20粒，精密称定总重，倾出内容物，研细混匀，精密称取细粉适量（约相当于盐酸氟桂利嗪20mg），置10mL量瓶中，分别精密加入标准溶液（1000µg/mL）0.75mL、1.50mL、2.25mL，平行制备各3份，加甲醇适量使溶解，涡旋5min，振摇10min，用甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，过滤，精密量取续滤液5mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别作为低、中、高浓度回收率溶液。照2.1色谱与质谱条件进样检测，加样回收试验结果见表3。加标回收率85.1%~93.7%，RSD为3.4%（n=9），符合ICH指南。

2.7 样品的测定

对34批不同处方的样品照2.2.1进行供试品溶液的制备，照2.1色谱与质谱条件进样检测，7.5min处的峰均未检测到，7.7min处的峰均有检出，以对照品两峰之和计算，结果在1~11mg/kg之间，均低于75mg/kg（0.0075%）的限度，符合TTC法控制标准。

3讨论

3.1 限度的确定

氟桂利嗪杂质8有警示结构，按TTC法控制，ICH M7指南指出，基于TTC计算可接受摄入量时，一个致突变杂质每人每天摄入1.5µg时其风险被认为是可以忽略的，基于毒理学关注阈值（TTC）的限值计算需结合药物日剂量与杂质毒性数据，科学制定安全标准。盐酸氟桂利嗪按照每日最大剂量20mg计算，氟桂利嗪杂质8可接受浓度限值（mg/kg）=1.5µg/d/20mg/d×103=75mg/kg（0.0075%）。

3.2 测定结果分析

氟桂利嗪杂质8分子中含环氧丙烷基团，该结构被ICH M7指南列为基因毒性警示结构。通过考察，34批不同处方的样品均未检出该结构杂质，但均检出其同分异构体。此同分异构体具体结构以及是否具有基因毒性，有待进一步研究。

4结论

本研究建立的高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）方法灵敏度高、专属性强，经方法学验证，线性范围、加标回收率及精密度等均符合痕量分析要求，适用于盐酸氟桂利嗪胶囊中潜在基因毒性杂质氟桂利嗪杂质8的质量控制。后续需重点关注其同分异构体的毒性及分离策略，以完善风险评估体系。该方法亦可为含环氧丙烷类基因毒性杂质药物的质量控制提供分析参考，助力解决痕量高危杂质的检测难题，推动药品质量控制技术的标准化发展。