摘 要 / Abstract
目前国内外已上市的各种联合疫苗有几十种，其主要目标是简化免疫程序、提高疫苗接种的便利性和依从性，从而提高疫苗接种率，为人类提供更全面更及时的保护。联合疫苗按照所含抗原种类分为细菌蛋白组成的联合疫苗、细菌多糖组成的联合疫苗、病毒组成的联合疫苗以及不同类别成分组成的联合疫苗，如蛋白-多糖成分组合、蛋白-病毒成分组合、蛋白-多糖-病毒成分组合等。本文从联合疫苗开发的基本原则、研发关键技术路线及研发所面临的挑战几个方面进行综述，为我国新型联合疫苗的研发策略提供技术参考。
Currently, there are dozens of combined vaccines available both domestically and internationally, with the main objective of simplifying immunization procedures, improving the convenience and compliance of vaccination, and ultimately increasing vaccination rates to provide more comprehensive and timely protection for humanity. Combined vaccines are categorized based on the types of antigens they contain, including those composed of bacterial proteins, bacterial polysaccharides, viral components, and combinations of different types of components, such as protein-polysaccharide protein-virus, and protein-polysaccharide-virus. This article reviews the basic principles, key technological routes, and challenges faced in the development of combined vaccines, providing technical references for the research and development strategies of new combined vaccines in China.
关 键 词 / Key words
联合疫苗；基本原则；研发关键技术；研发策略；抗原种类
combined vaccine; basic principles; key technologies in research and development; research and development strategy; antigen types
传染病流行是威胁人类健康和生命安全的重要问题。纵观人类抗击传染病的历史，疫苗接种是控制和消灭传染病最有效、最经济的卫生措施之一。我国自1978年起积极响应并正式实施儿童计划免疫，目前免疫规划疫苗已有14种，其中单价疫苗有9种，占全部疫苗的64%[1]。与此同时，非免疫规划疫苗的研发和应用也得到不断丰富。随着家长的防病意识逐渐提高，越来越多的家长希望为孩子接种更多的疫苗。然而，由于疫苗本身特性和疾病流行情况，大多数儿童用疫苗集中在小年龄段接种，势必造成婴幼儿期疫苗接种过于频繁，或将面临接种部位不够用的问题，另外还存在增加卫生部门的接种成本、降低幼儿接种的依从性、增加发生疑似不良反应的风险等问题。为此，世界卫生组织一直倡导接种联合疫苗来减少以上问题发生的可能[2]，美国和欧盟则通过法规引导联合疫苗的开发生产，比如允许不同的上市许可持有人合作开发联合疫苗、允许企业开展同时接种的探索性临床研究等，我国《疫苗管理法》也明确指出国家支持多联多价等新型疫苗的研制。
联合疫苗包括多联疫苗和多价疫苗。多联疫苗用于预防不同病原微生物引起的疾病；多价疫苗用于预防同一种病原微生物的不同血清型/株引起的疾病[3]。相比于单价疫苗，联合疫苗优势明显，主要体现在：(1)可以减少接种剂次，简化免疫程序，提高疫苗接种率和及时性，特别是在特殊原因导致儿童疫苗迟种或漏种的情况下，联合疫苗可以发挥更大的优势。(2)可以通过减少接种次数而降低婴幼儿因接种造成的疼痛、压力和不适，提高依从性。(3)可以相对减少疫苗中总佐剂、防腐剂或稳定剂的用量，降低不良反应的发生风险。(4)可以减少家长携带婴幼儿往返接种单位的频次、时间和误工成本，还可在一定程度上降低婴幼儿与家长等陪同人员感染相关传染病的风险。(5)可以减少接种人员的工作量，提高工作效率，降低潜在的接种差错和管理风险。(6)可以简化疫苗供应，减少冷链存储难度和缩减存储空间，降低接种成本。因此，联合疫苗是未来疫苗发展的重要方向之一。
1、联合疫苗开发的基本原则
安全、有效和质量可控是疫苗开发的3项基本原则，联合疫苗的研发也必须遵循上述原则。联合疫苗不是简单地将各个疫苗或抗原组分的混合，其在开发时应充分考虑多种组分联合后产生的相互作用对疫苗安全性和有效性的影响，以及联合疫苗中其他非抗原成分对有效抗原的影响。联合疫苗的质量控制包括对疫苗中各个组分的检测，以及对疫苗整体质量的检测。在临床研究中，应采用联合疫苗中各组分分别但同时接种作为对照组，同时还应充分评估各组分在体内的相互作用而产生的影响。因此，不能简单地采用一种固定的模式研究联合疫苗的安全性和有效性。根据联合疫苗的研究经验和结果，我国制定了《联合疫苗临床前和临床研究技术指导原则》，从疫苗研发生产、质量控制、临床研究多个方面对联合疫苗的开发提出要求[4]。
另外，在联合疫苗临床研究中，还需要考虑到联合疫苗中已有抗原成分对免疫程序中其他疫苗有效性、安全性的影响。比如，现在的肺炎球菌结合疫苗（pneumococcal conjugate vaccine,PCV）、脑膜炎球菌结合疫苗（meningococcal conjugate vaccine,Men）大多含有白喉类毒素（diphtheria toxoid,DT）或者破伤风类毒素（tetanus toxoid,TT）作为多糖载体，许多联合疫苗也含有白喉或者破伤风抗原成分，因此，需要评价含相同抗原成分的联合疫苗和其他疫苗免疫有效性的相互影响。
由于联合疫苗的抗原种类多、含量高、免疫机制复杂，在联合疫苗临床研究中，还需要进一步评价对计划免疫程序中接种时间较近的其他疫苗安全性、有效性的相互影响。中国食品药品检定研究院积极开展了含无细胞百白破疫苗（diphtheria,tetanus and acellular pertussis vaccine,DTa P）组分的联合疫苗与其他免疫程序相近疫苗的有效性相互影响研究，对DTa P基础免疫与PCV、Men、脊髓灰质炎灭活疫苗（inactivated poliomyelitis vaccine,IPV）、b型流感嗜血杆菌结合疫苗（haemophilus influenzae type b conjugate vaccine,Hib），以及DTa P加强免疫与水痘疫苗（varicella vaccine,Var）的有效性是否存在相互干扰进行了临床评价研究，结果表明上述疫苗对DTa P疫苗的有效性无显著影响。
2、联合疫苗技术路线
目前，世界上已批准使用的联合疫苗有几十种。按照所含抗原种类划分，联合疫苗分为细菌蛋白组成的联合疫苗、细菌多糖组成的联合疫苗、病毒组成的联合疫苗以及不同类别成分组成的联合疫苗，如蛋白-多糖成分组合、蛋白-病毒成分组合、蛋白-多糖-病毒成分组合等。
2.1 细菌蛋白组成的联合疫苗
由于蛋白类抗原本身具有免疫原性和抗原性，不同蛋白抗原间的免疫相互影响较小，采用不同蛋白抗原联合制备是联合疫苗开发中最常用的技术路线之一。细菌蛋白组成的联合疫苗中最具代表性的是百日咳、白喉和破伤风联合疫苗（DTP），是由百日咳菌体或百日咳抗原组分、精制DT和TT按适当比例配制而成，并吸附在氢氧化铝或磷酸铝佐剂上，用于预防百日咳、白喉和破伤风3种疾病[5]。
2.2 细菌多糖组成的联合疫苗
细菌中存在多种糖类物质，它们在细菌的识别、信号传递、黏附、感染及防御等方面发挥着重要作用。由于多糖的免疫原性，将特异性的多糖纯化后制成的疫苗称为多糖疫苗。多糖蛋白结合疫苗是通过化学方法将多聚核糖基核糖醇磷酸酯（polyribosylribitol phosphate,PRP）与载体蛋白共价结合，抗原类型从胸腺非依赖性抗原转变为胸腺依赖性抗原，能激发2岁及以下儿童、老年人和免疫缺陷者体内产生有效的免疫应答，并产生免疫记忆。Men、Hib和PCV多糖结合疫苗是儿童期免疫接种非常重要的一类疫苗。由于肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌等致病菌的细菌荚膜多糖抗原不同，可以分为多个血清型。为了能覆盖临床中主要致病的血清型，采用多种细菌血清型特异性多糖成分或者多糖-载体蛋白结合组合的多价疫苗是联合疫苗另一主要技术路线。从细菌多糖组成的联合疫苗的实际研发过程中，可以看出不同多糖结合疫苗在联合时应重点考虑不同载体蛋白的适用性、各抗原含量的配方比例等，以及在保证疫苗抗原发挥最大免疫原性的前提下，如何确定抗原的最低含量和载体蛋白的种类及含量。
2.3 病毒组成的联合疫苗
病毒组成的联合疫苗主要分为三类：灭活病毒联合疫苗、减毒活联合疫苗、病毒蛋白抗原的多价疫苗。灭活病毒联合疫苗包括以乙型肝炎疫苗（hepatitis B vaccine,HBV）为基础的联合疫苗，如甲型乙型肝炎联合疫苗、正在开发的肠道病毒71型-柯萨奇病毒A组16型联合灭活疫苗等；减毒活联合疫苗主要包括以麻疹-腮腺炎-风疹疫苗为基础的联合疫苗，如麻腮风联合疫苗（measles,mumps and rubella vaccine,MMR）、麻腮风水痘联合疫苗（measles,mumps,rubella and varicella vaccine,MMRV)[6-8]；病毒蛋白抗原的多价疫苗以多价人乳头瘤病毒疫苗为代表。
需要注意的是，联合疫苗中可能存在病毒疫苗间的干扰现象，如高浓度的麻疹和腮腺炎疫苗毒株易被干扰，Var与MMR同时免疫会抑制Var免疫应答，可通过提高Var剂量避免这一弊端。
2.4 不同类别成分组成的联合疫苗
不同类别成分组成的联合疫苗中包括细菌蛋白、细菌多糖、病毒蛋白等各类抗原成分，是现今联合疫苗开发的主要方向。在开发中除了需要考虑抗原成分相容性等因素外，还需要充分考虑免疫程序的相容性，将免疫程序接近的不同类别疫苗联合是这类疫苗开发的重点。
新型联合疫苗的发展开始于DTP联合疫苗。原因主要是百日咳、白喉和破伤风这3种儿童传染病在短期内尚不能消灭，会长期使用这种疫苗；DTP联合疫苗安全性好，2月龄即可接种；DTP联合疫苗中的DT、TT抗原性质稳定，与其他抗原成分联合不易产生干扰现象等。其中，DTa P联合疫苗中各抗原组分均为纯化抗原，组分清晰，更利于分析不同抗原间、抗原与非抗原成分间的相互作用，现今以DTP为基础的联合疫苗多为DTa P联合疫苗[9-10]。
基于上述原因，在传统DTP联合疫苗的基础上，含其他各种疫苗成分包括多糖成分、灭活病毒成分的新型联合疫苗得到了飞速发展。Hib免疫程序与DTP的免疫程序完全相同，IPV、HBV免疫程序与DTP基础免疫程序部分相同或具有相似性，具备较好或一定的多联疫苗研发基础。Hib、IPV和HBV与DTP联合组成的四联、五联、六联疫苗相继问世。此外，还有儿童用百白破-IPV疫苗和成人用百白破-IPV疫苗等。越来越多的国家和地区逐步开始使用含百白破成分的四联、五联或六联疫苗。其中，超过100个国家和地区将DTP-HBV-Hib作为基础免疫，在有关国际组织的援助支持下，多在中低收入国家和地区使用。
3、联合疫苗面临的挑战
虽然近年来成功研发的和正在研发的联合疫苗种类日益增多，但是联合疫苗并不是简单地将多个单价疫苗的混合，在其研发、制备、评价和使用中还存在许多关键问题需要深入研究和解决，面临很多挑战，包括全液体剂型技术、载体蛋白免疫原性评价及与联合疫苗中已有抗原成分的替代、佐剂对联合疫苗中抗原成分的影响、免疫程序对联合疫苗的影响等。
3.1 全液体剂型技术
由于含DTP成分的联合疫苗多数含有多糖结合疫苗组分，而铝佐剂对部分多糖结合疫苗的有效性有一定影响，因此现有的联合疫苗大多是将多糖结合疫苗组分单独分装，临用前混合，以最大程度降低影响。但是，临用前混合使用仍有无菌风险和使用过程中发生错误的风险。全液体剂型联合疫苗通过对佐剂工艺和制剂工艺的优化，开发单剂量、单一包装、无需临用前混合的疫苗成品，避免了冻干工艺引入的安全性风险及产能的限制，同时避免了冻干疫苗在免疫接种前需进行繁琐的复溶过程，大大降低了接种安全性风险和工作量。从疫苗工艺的先进性来说，全液体疫苗更胜一筹，操作效率更高，更有利于安全注射。
在全液体疫苗的研发过程中，关键是通过抗原在液体制剂中的稳定性研究、各抗原组分间相互作用的评估、抗原含量的优化、制剂工艺的革新，研制出安全有效、使用方便的产品，对于含佐剂的疫苗制剂，还应包括佐剂的制剂配方对抗原稳定性的影响等。
3.2 载体蛋白免疫原性评价及与联合疫苗中已有抗原成分的替代
百白破疫苗和多糖蛋白结合疫苗常被开发为联合疫苗或联合接种或间隔接种使用。目前多糖蛋白结合疫苗中所用的载体蛋白主要是DT、TT和白喉毒素的无毒突变体交叉反应物质197(cross-reacting material 197,CRM197）。DT和TT既作为疫苗抗原来免疫，又作为多糖结合疫苗的载体蛋白来重复应用，是否会对疫苗的免疫原性产生影响越来越受到研究人员的关注。主要包括以下几种情况：载体蛋白启动效应，载体蛋白诱导的表位抑制效应（carrier-induced epitope suppression,CIES）和旁观者干扰效应。
载体蛋白启动效应一般是先接种含有DT或TT的疫苗，再接种含相同载体的多糖结合疫苗，对疫苗免疫应答所产生的效应。这种预先诱导的针对载体蛋白的抗体可能会增强连接在同一载体蛋白上的多糖的免疫应答，但预存的过量载体蛋白抗体也有可能会抑制连接在同一载体蛋白上的多糖的免疫应答。载体蛋白启动效应增强免疫应答可能是针对载体蛋白的特异性辅助性T细胞（T helper cell,Th）和T细胞介导的细胞因子增加所致。在动物体内进行的几项试验显示，低剂量TT(0.025～0.25μg）初免对以TT为载体的PCV-TT和MenTT的多糖抗体应答具有增强作用；但高剂量TT(25μg）初免则会对多糖抗体应答产生抑制作用。在儿童和成人中也观察到了大量的载体蛋白启动效应。与未接种TT或DT疫苗的婴儿相比，提前接种TT或DT疫苗，然后接种Hib-TT/DT的婴儿在初次接种和加强接种Hib后，PRP的抗体水平更高[11-18]。
除上文所述过量的载体蛋白初免可能会减弱多糖的免疫应答以外，同时接种相同载体蛋白的多糖结合疫苗可能会引起多糖免疫应答水平的降低，即载体蛋白诱导的表位抑制效应。其中可能涉及的机制有：(1)预先存在的针对载体蛋白的抗体可能通过空间位阻效应，有利于抗载体B细胞反应，而不利于抗多糖B细胞反应。(2)优势载体特异性B细胞可能通过竞争机制剥夺了多糖特异性B细胞、T细胞等必需资源。(3)在免疫应答后期，调节性T细胞会进行负向调节，避免过强的免疫应答[11]。研究显示，11价双载体肺炎球菌结合疫苗（Pnc DT/TT11,7个血清型多糖与TT偶联，4个血清型多糖与DT偶联）与全细胞百日咳疫苗（whole cell pertussis vaccine,w P）合用，破伤风载体介导的反应也可能受到一些抑制，但这种抑制被w P的辅助作用掩盖了。通过将w P替换为无细胞百日咳疫苗（acellular pertussis vaccine,a P），这种佐剂效应被消除，所有与TT结合的肺炎球菌结合物的反应都显著降低，显示了载体蛋白诱导的表位抑制效应[19]。随着婴儿期使用多种含a P的疫苗的增加，可能需要新的佐剂和载体蛋白技术。
旁观者干扰效应即多种疫苗共同接种，会影响同类载体或以其他载体蛋白制备的多糖蛋白结合疫苗的免疫作用。以CRM197为载体蛋白的多糖蛋白结合疫苗，可能是通过DT和CRM197之间共用的T细胞机制介导，并且会影响共同接种的其他抗原。这种旁观者干扰效应在以CRM197为载体蛋白的结合疫苗使用中已被证实，特别是乙肝表面抗体（HBs Ab）和Hib抗体应答容易受到干扰[20]。
针对联合疫苗中已有抗原成分作为载体蛋白使用时会出现载体蛋白效应，有可能降低疫苗免疫原性，迫切需要开发新的载体蛋白，避免联合疫苗中已有抗原成分作为载体蛋白多次重复免疫接种。另外，应探索优化联合疫苗中已有抗原的含量，可以通过有效性的评估适当调整相应抗原的含量，在保证有效性的同时降低抗原含量，获得更佳的安全性。
3.3 佐剂对联合疫苗中抗原成分的影响
铝佐剂广泛应用于联合疫苗，包括氢氧化铝、磷酸铝和无定形羟基磷酸铝硫酸盐。当蛋白质抗原吸附在铝佐剂颗粒时，通过表面的相互作用，可能影响其构象表位和稳定性。氢氧化铝的正表面电荷吸引带负电荷的离子，在粒子附近形成表面层。与疫苗制剂溶液的p H值相比，氢氧根离子的吸引力使该层p H值增加了1～2个单位。磷酸铝佐剂颗粒周围的表面层p H值也会降低。吸附到铝佐剂上的抗原暴露于与溶液中存在的抗原不同的p H值，这有可能会加速某些蛋白质脱酰胺和氧化。微环境p H值的升高可能解释了Hib荚膜多糖-蛋白结合物中的磷酸二酯键在被氢氧化铝吸附后发生水解的原因，这种水解过程在碱性条件下会加速。抗原与铝佐剂的吸附，可能对其稳定性没有影响，也可能降低或者增强稳定性。采用生物、物理等技术方法对联合疫苗中铝佐剂对各抗原成分的影响进行特异性评估非常必要。
抗原的吸附，通常会增强其免疫反应。铝佐剂的免疫刺激作用来自多种机制，包括减缓抗原从给药部位扩散，增加炎性细胞积聚，激活补体，诱导单核细胞分化为树突状细胞以及树突状细胞对抗原的摄取、抗原呈递和CD4+T细胞的活化等。但铝佐剂诱导Th1和Th17应答反应弱，而这些应答反应可能是诱导针对疟疾和结核等传染病的保护性免疫所必需的。研究发现，针对不同机制激活免疫反应的佐剂与铝佐剂的结合可以产生协同效应，可能诱导更有效或更持久的免疫反应，并可减少疫苗中的抗原使用量。
3.4 免疫程序对联合疫苗的影响
在联合疫苗使用中，免疫程序的设定对疫苗诱导产生免疫应答有重要的影响。如DTa P-IPV-Hib联合疫苗在法国的临床试验中，分别按2、3、4月龄和2、4、6月龄两个免疫程序进行免疫，后者诱导产生的特异性抗体普遍高于前者[21-24]。应在临床研究阶段探索联合疫苗的免疫程序，以确定疫苗接种在最短的时间内诱导产生良好的免疫应答。另外，由于不同国家规定的免疫接种程序不同，联合疫苗应有接种程序的可塑性。如美国规定的HBV免疫程序比较灵活。使用DTP-HBV联合疫苗时，出生首剂用单价HBV免疫，2、4、6月龄用DTa P-HBV四联疫苗免疫[25]。此程序中HBV多免疫一个针次，对免疫效果没有太大影响。在我国，目前含DTP-HBV联合疫苗的接种程序与现行HBV免疫程序（0、1、6月龄）存在一定冲突，是含DTP-HBV联合疫苗未来应用所面临最主要的挑战，需要解决的问题包括第2剂次接种推迟对HBV免疫原性和防控效果的影响、多剂次接种的安全性以及出生剂次与后续剂次之间的交替使用等问题。另外，联合疫苗使用中还应注意不同生产厂家制造的联合疫苗能否互相使用、抗原的重复免疫等问题。
4、展 望
联合疫苗不仅为个体提供更全面、更及时的保护，而且在全球或单个国家内都会产生重要的公共卫生意义，充分显现了疫苗预防疾病的高效性。尽管成功研制一种联合疫苗面临诸多挑战，包括不同组分之间的相容性问题、抗原含量的优化、佐剂工艺的优化、制剂工艺的革新、理想的临床方案和免疫程序的适应等，但随着生物技术的快速发展，我国联合疫苗的研发取得了很多重大突破，如13价PCV的获批上市、IPV的成功研制、DTa P-IPV-Hib等疫苗的加速研发。我们应该借鉴国内外的宝贵经验，加大联合疫苗前期基础研究的投入，解决当前联合疫苗面临的瓶颈问题，为我国新型疫苗的研发及免疫策略优化提供更多的选择。
引用本文
谭亚军,马霄*.联合疫苗研发关键技术[J].中国食品药品监管,2023(12):58-63.
