角膜新生血管（CoNV）的特征是角膜组织中血管的异常生长，是世界范围内造成视力损害的主要原因。目前，可用的治疗方案疗效有限，并与生物障碍和清除机制导致的不良反应相关。为了解决这一挑战，湖南大学史俊峰教授和中南大学湘雅二院眼科李芸主任合作开发了一种新的局部传递系统——Gel 2_1&Eylea——一种由细胞穿透肽1介导的游离滴眼液水凝胶。Gel 2_1&Eylea具有优越的膜通透性，增加稳定性，延长药物在眼表的保留时间，从而提高药物疗效。在兔CoNV模型中，Gel 2_1&Eylea显著降低新生血管密度，对正常角膜巩膜角膜缘血管无不良影响，具有良好的疗效和生物相容性。本研究确定了一种很有前景的治疗CoNV的方法，也可能有利于其他眼部新生血管疾病。
相关研究内容以“Aflibercept Loaded Eye-Drop Hydrogel Mediated with Cell-Penetrating Peptide for Corneal Neovascularization Treatment”为题于2023年9月7日发表在《Small》上。
图1 Gel 2_1&Eylea治疗角膜新生血管的应用
本研究设计一种新型的细胞穿透肽1，它可以中和带负电荷的Eylea并穿透角膜基质（1&Eylea）。使用水凝胶可以增加1&Eylea的保留时间和摄取效率。因此开发了一种新型的细胞穿透肽（称为Gel 2_1）介导的Gel2_1&Eylea来治疗角膜新生血管。体外和体内实验表明，与单独使用Eylea相比，滴眼液Gel2_1&Eylea具有较高的相容性，对抗血管生成的治疗效果更优越（图1）。
图2 1&Eylea的制备和表征
摩尔比为1：1的1&Eylea配合物带负电荷，而摩尔比为1：10的1&Eylea配合物则带正电荷，表明10等量的带正电荷的1可以通过静电相互作用中和带负电荷的Eylea。从图2B中可以看出，1和Eylea形成聚集体，而改变1的浓度并没有导致明显的形态变化。荧光素标记的多肽1在孵育1h后可以进入人角膜上皮细胞-7（HCE-T）细胞的细胞质（图2C）。
图3 滴眼液水凝胶的生物物理表征
在材料配方过程中加入Eylea，能够精确地控制封装药物的浓度，药物-肽复合物形成一个不透明的水凝胶（图3A），表明在水凝胶基质中存在较大的聚集体。透射电镜图像显示，水凝胶基质由纳米纤维组成，也观察到纳米颗粒（图3A），表明1&Eylea复合物的封装并没有显著改变Gel2_1&Eylea的形态。所有组在216 nm处观察到一个负峰，表明1&Eylea复合物封装后形成稳定的β-sheet结构（图3B）。为了评估1&Eylea对Gel 2_1&Eylea的流变特性影响，监测了存储模量（G'）随时间的函数，发现剪切恢复性能非常接近Gel2（图3C）。38%的Eylea在4h内从Gel 2_1&Eylea（1：10）中释放出来，而大约31%的水凝胶从1：1的比例释放出来（图3D）。如图3E、F所示，绝大多数HCE-T细胞显示钙黄绿素AM（活细胞）染色阳性，而在所有水凝胶组中只观察到少数碘化丙啶（PI，死细胞）染色的细胞。这些结果表明，该水凝胶是无毒的，使其成为开发生物相容性眼液基质的一个有前途的候选药物。
图4 Gel2_1&Eylea的体内疗效评价
术后5天观察到角膜间质内新血管明显充血（图4A），治疗前各组间CoNV面积无差异（图4C），证实CoNV模型的成功建立。不同配方处理后的CoNV面积占角膜总面积的百分比（图4D）与CoNV面积呈相同的趋势。综上所述，用细胞穿透肽1介导的Eylea水凝胶滴眼液水凝胶具有良好的CoNV抑制能力。
图5 Gel 2_1&Eylea选择性抑制病理性新血管
治疗14天后，使用前段光学相干断层扫描血管造影（AS-OCTA）获得血管图像（图5A），并使用Image J软件生成二值化和骨骼化图像。与Eylea组和NS组相比，Gel 2_1&Eylea组CoNV的血管面积密度（VAD）值显著降低（图5B），表明Gel 2_1&Eylea在降低新血管密度方面非常有效。CoNV的容器直径指数（VDI）值在三组间没有显著差异（图5C），表明Gel 2_1&Eylea对血管形态没有显著影响，是安全的。三组患者角膜缘的VAD和VDI值均无明显变化（图5D、E）。在角膜上观察到一个较大的荧光素斑点，这是由CoNV模型发展过程中出现的缝合线引起的（图5F 白色箭头）。NS组、Eylea组和Gel 2_1&Eylea组的染色评分差异无统计学意义（图5G）。结合图5D、E、G中的数据，这些结果表明，Gel 2_1&Eylea具有较高的生物相容性。
虽然抗VEGF药物被认为是治疗眼部新生血管疾病最有效的治疗方法，但由于存在多种屏障和清除机制，传统的局部滴眼液的疗效有限。为了解决这一挑战，本研究开发了一种含有细胞穿透肽1的新型滴眼液水凝胶。由此得到的Gel 2_1&Eylea具有剪切诱导的变薄特性，可以用作滴眼液。封装的1&Eylea复合物可以迅速从水凝胶基质中释放出来，而细胞穿透肽的存在促进Eylea的渗透。水凝胶的使用可以延长药物的停留时间，从而加强对病理区域的渗透。体内外实验表明，Gel 2_1&Eylea可以抑制新的异常血管发育，而对正常血管的影响很小。总之，本研究表明2_1&Eylea凝胶可以作为Eylea治疗角膜新生血管的一种有效和安全的递送系统。
文章来源：https://doi.org/10.1002/smll.202302765
