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未知杂质定性之液质图谱中分子量的解析原则

嘉峪检测网        2020-10-30 09:52

根据ICHQ3A的要求,当原料药最大日剂量大于2g/天,杂质的鉴定阈值为0.05%;当原料药最大日剂量小于等于2g/天,则该杂质的鉴定阈值为0.1%或日摄入量1.0mg(以较低者为准)。因此在进行药物质量研究过程中,作为一名分析研究者经常需要对未知杂质进行定性处理,而定性一般需要使用高分辨质谱仪去研究,首先的第一步就是需要确定其分子量,只要在质谱图中找到分子离子峰就能确定化合物的分子量。所以说确定化合物的分子离子峰是分析研究者必须具备的技能。那么,在使用高分辨质谱定性时如何去确定分子离子峰呢?编者和大家分享下相关的知识与心得。

 

1、首先我们先看下什么是分子离子

分子离子是化合物分子通过某种电离方式,失去一个外层价电子而形成带电荷的离子。它一般含有奇数个电子,位于质荷比最高端,因大多数分子容易失去一个电子而带一个正电荷,

 

因此分子离子峰确定之后即可确定化合物的相对分子质量。

 

准分子离子:比分子离子峰多1个质量单位或者少1个质量单位的分子离子,因其比分子离子状态稳定,故在质谱图上就显示为M+1或者M-1峰,通过准分子离子峰可以间接的或得化合物的分子量。

 

现在我们使用的高分辨质谱使用较多的都是ESI或者APCI离子源,化合物通过该离子源的电离方式为化学电离,属于一种软电离的方式,通常产生准分子离子峰,有时也会产生M+Na,M+NH4等加和离子峰。

 

2、确定分子离子峰原则

 

1.化合物的分子离子峰一般出现在质谱图的最右端,是最高质量的离子。

 

2.在高质量区,它能合理地丢失中性碎片而产生重要的碎片离子。

 

分子离子峰进行化学键断裂所丢失的碎片应为具有合理组成的有机基团或者稳定的小分子,如:M-15(甲基),M-17(羟基),M-18(水)、M-31(甲氧基)等;一般分子离子峰的左面不可能出现质量为4-13,21-26,37,50-53,65,66等质量单位的峰,因为分子离子峰不可能裂解出两个以上的氢原子和小于一个甲基的基团。如果最高质量端出现此差额,则此最高质量峰就不是分子离子峰。一般的裂解碎片见下图。

未知杂质定性之液质图谱中分子量的解析原则

3.分子离子峰质量数遵循氮原则

 

在组成有机化合物的元素中,对绝大多数天然丰度最高的同位素而言,偶数质量的元素具有偶数化合价,奇数质量的元素具有奇数化合价,如12C、16O、32S、…的化合价是偶数,1H、35Cl、31P 的化合价为奇数,只有氮同位素14N 的质量数为偶数,其化合价却为奇数,成为一种特例。

 

因此,由C、H、O组成的化合物,分子离子峰的质量一定是偶数。由C、H、O、N组成的化合物,如果含有奇数个氮原子,其分子离子峰的质量是奇数;含偶数个氮原子,其分子离子峰的质量则是偶数,这就是氮原则。

 

经元素分析确定某化合物的元素组成后,若最高质量离子的质量与氮规则不符,则该离子一定不是分子离子。

 

4.在使用ESI离子源质谱时要注意分子离子形成M+1和M-1以及其他加和峰的可能性

 

(1)一般醚、酯、胺、酰胺、氰化物、氨基酸酯、胺醇等可能有较强的M+H峰;芳醛、某些醇或者某些氮化合物可能有较强的M-H峰。

 

(2)常见的加和离子峰:

 

正离子方式常出现如下离子:M+Na;M+K;M+Li;M+NH4;M+ACN;2M+H;2M+Na等

 

负离子方式常出现如下离子:M+TFA;M+Acetate;M+Formic;M+Cl等

 

(3)出现何种加和离子与样品分子性质和样品溶液相关。

 

(4)当溶液中样品浓度太大时,会出现二聚体准分子离子峰(2M+H+)或者二聚体加和离子峰,如2M+Na+。

 

(5)ESI技术无法使非极性分子离子化,故非极性样品不出峰。

 

(6)常见的本底离子

 

m/z 50-150,溶剂离子[(H2O)nH+,n=3-112]

 

m/z 102, H+乙腈+乙酸,C4H7NO2H+

 

m/z 288、316,2mm离心管的产生的特征离子

 

m/z 149、279、391、413,管路中邻苯二甲酸酯及衍生物

 

m/z 538,乙酸+氧+铁(喷雾管),Fe3O(O2CCH3)6 

 

3、常见问题及解决

 

 

1.分子离子峰不出现或者丰度较低难以确认,可以根据情况改变条件予以确认。

 

(1)查看样品结构和性质

 

通常分子离子峰稳定性与结构有关,一般碳链较多,碳链较长及含有支链的分子,分裂几率较高,分子离子的稳定性较低,饱和醇类、胺类化合物的分子离子峰很弱;而具有π键的芳香族化合物及具有共轭烯烃的分子,分子离子峰稳定,其值较大。

 

(2)改变流动相的pH值

 

流动相的pH值可以影响化合物的离子化效率,一般正离子离子化方式选择低pH,负离子方式选择高pH。注意在调节流动相pH时要注意添加具有挥发性的酸或者其盐,经常使用的酸为甲酸及其盐、乙酸及其盐,常用的碱为氨水。

 

(3)查看使用的溶剂

 

通常正离子模式下使用用甲醇好,负离子模式使用乙腈好些。

 

(4)查看流速

 

一般使用质谱连接的液相为二元高压超高效液相色谱仪,使用色谱柱为小粒径的短柱,选择合适的流速可以提高分子离子峰灵敏度。

 

(5)干扰杂质的影响

 

使用溶剂的纯度、水的纯净程度等,当成分复杂,杂质太多时,竞争使被测物离子化程度低。故在使用试剂时建议选择质谱级别的试剂,水使用超纯水。

 

(6)降低轰击电子的能量。

 

常用的电子轰击能量为70eV,如果测得分子离子峰较低,可以进行改变电子轰击能量降低到15eV 以减少形成的分子离子继续断裂的几率,降低了碎片离子的丰度,使分子离子峰的相对丰度增加,从而可能辨认出分子离子。

 

(7)降低样品的气化温度

 

气化温度的降低可以减少分子离子进一步断裂的可能性,分子离子峰的相对丰度增加。

 

 

2.通常在质谱图中质荷比最高的位置就是分子离子峰,但是有时最高质荷比峰不一定是分子离子峰。其原因为:

 

(1)当出现M+n(n=1.2。。。)同位素峰时,同位素峰可能出现在质荷比最高处。

 

(2)当样品不纯或者仪器有污染时,杂质峰可能出现在最高质荷比处。

 

(3)当样品分子的稳定性差时,分子离子峰很弱,甚至不出现,此时出现最高质荷比的离子是碎片离子峰而不是分子离子峰。

 

4、举例分析

未知杂质定性之液质图谱中分子量的解析原则

这是一张ESI离子源获得质谱图,首先我们看到的是一个很高的基峰,此时一般把其先假设为准分子离子峰(M+1峰,前面提到了一般ESI离子源获得的基本都是准分子离子峰或者其他加和峰,很少直接得到分子离子峰);然后进行验证,其旁边有一个较大的峰值为190.0295,如果168.0477是M+1峰,两者相差为22,此时推断其为M+Na峰;图中显示还有一个较大值为357.0699,此时和M+1峰相差为199(M+Na),此时可以进行推断其为2M+Na峰,通过这些小的峰值,说名我们的推断准分子离子峰为168.0477是正确的,从而可以判定这个化合物的分子量为167。

未知杂质定性之液质图谱中分子量的解析原则
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来源:药事纵横