1范围

细胞毒性试验是利用细胞体外培养方法来评价医疗器械或其浸提液可滤出成分中急性细胞毒性的潜在性。

2 试验项目选择（推荐）

根据GB/T16886.5-1997标准中有关细胞毒性试验的要求，现推荐下面任何一种细胞毒性试验方法评价医疗器械的细胞毒性，即琼脂覆盖法，分子滤过法，生长抑制法。

3 试验条件

（1）细胞株

可以使用已建立的细胞株，目前我国使用较多的是L-929（小鼠结缔组织成纤维细胞）和V-79（中国地鼠肺成纤维细胞）。

（2）培养基

培养基及其血清浓度的含量应能适合所选择细胞株的生长，满足细胞生长的需要。培养基内含抗生素的量应不引起细胞毒性，以免影响材料的评价，含血清和谷氨酰胺的培养基在2~8℃贮存不能超过一周，只含谷氨酰胺不含血清的培养基在2~8℃贮存不能超过一个月，培养基的pH值在7.2~7.4之间，所有培养用液都应是无菌的。

（3）样品的制备

• 试验样品的制备。试验样品应选择材料本身或其浸提液进行。试验材料应用最终产品。制备材料浸提液的条件往往是夸大临床应用的条件来评价样品潜在的细胞毒性，但不能引起样品严重的变化（如溶解或其化学结构改变），浸提液应在制备后的24h内使用；固体材料应至少有一个平面使其利于在细胞层或琼脂层相接触，各种试验样品在试验时均应经无菌处理。

• 阴性对照。应是已知无细胞毒性的物质。对于合成高分子材料，高密度聚乙烯较为适宜，牙科材料则可用氧化铝陶瓷作为阴性对照。

• 阳性对照。是已知的有一定细胞毒性的物质。推荐含锡的聚氯乙烯作为固体材料或浸提液的阳性对照。稀释苯酚亦可作为浸提液的阳性对照。

4 试验方法

1)琼脂覆盖法

• 目的：本试验是为了评价医疗器械科浸提成分的急性细胞毒性。
• 范围：本试验方法适用于固体（粉末，纤维状，金属），液体等试验材料。
• 试验样品的制备。

试验样品：将试验样品制成100mm2的圆形，要求边缘光滑整齐。液体材料用0.1mL的样品吸收在同面积的无菌滤纸片或纤维素上。

阴性对照：为已知五毒的材料（反应指标为0/0）高密度聚乙烯由于有良好的光学性质且易于切割被认为最为适宜。制备方法用试验样品。

阳性对照：为已知的有一定毒性的样品材料（反应指标为2/2），含锡的聚氯乙烯是一种较为合适的阳性对照。制备方法同试验样品。

细胞株：推荐使用L-929细胞株。试验用细胞为传代（48~72）h生长旺盛的细胞。

培养基和试剂：用于细胞培养液都应无菌。

磷酸盐缓冲液（PBS-Complete）:

加水至1000mL,过滤灭菌，4℃贮存。

中性红浓缩液：

加水至2000mL，用磁力搅拌器搅拌1h后，滤纸过滤，高压消毒，4℃避光保存。

中性活体染液：

避光，新鲜配备。

消化液：为0.25%胰酶与0.2%EDTA混合液，其配比为1:9.

培养液：为Eagle’sMEM，内含牛血清10%~15%（胎牛血清最好），青霉素、链霉素为每毫升培养液100单位。

Eagle’s 琼脂培养基：

把加热熔化的琼脂和2倍Eagle’s培养基无菌混合后置50℃水浴中备用。

试验平板：90mm直径的玻璃培养皿，按组织培养常规灭菌。

试验步骤（在无菌条件下进行）

制备细胞悬液：将传代（48~72）h细胞经消化液作用后，使贴壁细胞悬浮于营养液中，调节细胞悬液浓度至3×10^5个细胞/mL。

制备平板细胞单层：每只平板中加入10mL制备好的细胞悬液，轻轻转动培养皿，以使细胞均匀的分布在培养皿底部。放入含5%CO₂的37℃恒温培养箱中培养24h，使其成为融合但不稠密的网状细胞单层。

制备琼脂培养基平板：细胞原培养液，留下融合好的细胞悬液，将混合的Eagle’s琼脂培养沿平皿壁加入平皿内，每皿10mL.轻轻转动平皿，使琼脂培养基分布均匀，并使其在室温下凝固。

染色：有两种方法可供选择。取10mL新鲜配制的中性红活体染色，轻轻地置于已凝固的琼脂表面中央，染液应覆盖整个表面，避开强光，37℃染色15min，倾斜平板并弃去多余染液；将中性红染液加入熔化的Eagle’s琼脂培养基（0.1mL中红加入10mL培养基中），混合后覆盖于细胞单层上。

放置试验样品：应立即放置样品，最迟不超过染色后1h。

将样品对称地放在琼脂表面，可轻轻加压以琼脂表面接触，但不可破坏琼脂表面，在放置样品30min内将培养放入CO₂培养箱内培养24h。

试样位置：一只阴性样品，一只阳性样品和良知相同的试样对称地放置在培养皿的琼脂表面，试样边缘距培养皿的边缘15mm，每一种试验样品至少做两只培养皿。

结果评定标准

在白色背景下，观察样品周围及样品下面脱色区范围。在阴性样品周围和下面的细胞单层应达到标准的反应，即R=0/0，阳性样品亦应达到标准反应，即R=2/2，否则该培养皿弃之。

反应指标：反应情况用反应指标“R”来表示，即

R=Z/L

式中，Z为区域指标（如表1-4-1所示），与脱色区大小有关；L为细胞溶解指标（如表1-4-2所示），与区域细胞溶解的范围有关。

表1-4-1 区域指标

表1-4-2 溶解指标

反应指标应作为2个数来报告（不是一个分数），两个指标的大小都应很明显，对每一只样品应报告其区域指标的指标平均值和溶解指标的平均值。无论何种原因，一个指标的四个值丢失了一个以上，则该试验弃之，如仅丢失了一个，则其他三个的平均值可作为指标来报告。

在同一试验中，4个相同的样品指标大小有2个或2个单位以上的差异。如果数值在0~3以内，则应重复试验；如数值是4~5，表示有高度弥散的毒性物质，则不必重复试验。

为了试验的可靠起见，规定每种样品重复试验一次以上，最后报告其指标的平均值。

试验报告

包括试验材料和阴、阳对照材料的化学名称、商品名称、产品批号、生产厂家以及材料试验尺寸规格与消毒方式。

指出试验用细胞名称、来源、培养基种类。

描述操作步骤：包括制备细胞悬液、制备细胞单层、覆盖琼脂、染色等。

显微镜下观察试验结果。

对试验材料进行评价

2）分子滤过法

目的：本试验用于试验材料的细胞毒性评价。

试验材料的准备。

试验样品

按照生产厂家的产品说明准备试验样品，将试验样品制备成直径7mm的圆形膜片，要求有一个平面，使其可以充分地与滤膜接触，试验样品的质量不应超过3g，亦可用直径为7mm的纤维素片汲取0.1mL浸提液放置在分子滤膜片上。

空白对照样品：只长在单层细胞的分子滤膜或单纯的分子滤膜。

阳性对照样品：推荐使用稀释的苯酚溶液作为阳性对照样品。

细胞株、培养基

细胞株：人上皮细胞株（HeLa）、小鼠结缔组织成纤维细胞株（L-929）。

培养基：用于细胞培养的培养用液都应是无菌的。

生长培养基：采用Eagle’s培养基，加10%胎牛血清，1×10^5IU/L青霉素，100mg/L链霉素及10mmol链霉素和10mmol/L HEPES缓冲液。

试验步骤

消化收集细胞并用生长培养基调节细胞浓度为1.5×10^5/mL,在直径为50mm组织培养皿中放置的直径47mm、孔径0.45μm的分子滤膜加上6mL细胞悬液，在5%二氧化碳培养箱内培养24h。

加5mL约40℃的琼脂培养基于一空白的组织培养皿内，使其室温下凝固。将用37℃磷酸缓冲液漂洗后的附有单层细胞的分子滤膜，细胞面向下放置在琼脂培养基面，每一滤膜上放置3~5个样品，每种材料测10个样品，空白对照和阳性对照操作方法相同。放置样品后，在5%CO₂培养箱内继续培养2h。

培养后移去试验样品并轻轻地从琼脂培养基上拿下分子滤膜，用细胞化学方法来测定细胞单层的琥珀酸脱氢酶的活性。37℃孵育3h后，用蒸馏水洗涤。风干。

结果评价

在显微镜下检查滤膜，含细胞单层的膜片染为深蓝色，没有细胞的滤膜用来观察试验材料可能对滤膜产生的影响。按照表1-4-3判断试验样品的细胞毒性。

按照记分系统，对材料的细胞毒性进行分级、报告。

3）细胞生长抑制法[MTT（四咪唑）比色法]

（1）细胞株：L-929（小鼠结缔组织成纤维细胞）。

（2）仪器：免疫酶标仪。

（3）培养液和试剂

培养液：详见琼脂覆盖法。

消化液：详见琼脂覆盖法。

PBS缓冲液：详见琼脂覆盖法。

MTT（四咪唑）：浓度为5mg/mL溶于PBS中。

（4）样品制备：将无菌的样品浸在培养液中（含10%胎牛血清）静置24h，浸提液量与样品表面积之比为10mL/cm²,浸提液制备好后，将其一般用培养液稀释成溶度为50%.

（5）培养（1~2）d的L-929细胞，吸收原培养液，加入消化液，消化，吸收消化液，加入新配置的培养液，使细胞成悬浮液计数，稀释成1×10^4个细胞/mL。接种于3块96孔塑料板上，每组4孔，每孔100μL。在37℃CO₂培养箱中培养24h，使细胞贴壁，24h后，加样品，将每孔中原培养液吸除。空白对照加新配置的培养液100μL，试验组分分别加100%和50%样品浸提液，放入37℃CO₂培养箱中培养，在2d、4d、7d时，分别各取出一块培养板，吸除样品浸提液加入20μL/孔MTT液，继续培养6h，然后吸除，再加入150μL/孔二甲基亚砜，振荡10min，在免疫酶标仪上以500nm波长测吸收值，通过下式计算相对增殖率（RGR）：

（6）结果评价：根据RGR均值，岸标1-4-4所列评分标准对样品细胞毒性程度进行评价。

表1-4-4 细胞相对增殖率评价

参考：徐秀林. 无源医疗器械检测技术[M]. 北京：科学出版社，2007：17-22.