功能食品是一种不以治疗疾病为目的的可实现特定人群功能化、精准化营养补充的特殊食品。功能食品中发挥核心作用的功能因子（如氨基酸、功能性糖类、维生素、微量元素、益生菌、多糖及功能性脂类等）需针对不同特殊人群的营养需求进行科学配比和精准调控：对于易过敏人群，应添加低致敏性的多肽或氨基酸等蛋白质水解产物；苯丙酮尿症患者的功能食品必须严格控制苯丙氨酸（Phe）添加量；而早产儿配方食品则需要适当提高精氨酸、胱氨酸、酪氨酸 (Tyr) 和牛磺酸等关键氨基酸的比例。作为蛋白质的基本组成单位，氨基酸不仅参与组织代谢、生长发育和损伤修复等生命过程，更是维持机体正常生理功能的重要代谢物。因此，建立功能食品中游离氨基酸的精准定量分析方法具有关键意义。

目前，常见的氨基酸检测方法有分光光度法、色谱法、毛细管电泳法、红外吸收光谱法、氨基酸分析仪法和液相色谱-质谱法。光谱法多用来测定氨基酸总量，对单个氨基酸难以精准定量；氨基酸分析仪法作为氨基酸常规检测方法，存在分析时间长、样品用量大、灵敏度较低等缺点；毛细管电泳法灵敏度低、重现性较差；色谱法往往需要衍生化来提高分离能力和灵敏度，且存在检测效率低、应用范围较窄等缺点。基于此，研究人员建立了一种前处理简单、分析快速、基质干扰小，灵敏度高的超高效液相色谱-串联质谱法，用于定量检测功能食品中20种天然氨基酸。

1 试验方法

1.1 乳粉、米粉样品

称取样品置于离心管中，加入甲酸溶液（乳粉）或 （米粉），振荡充分溶解，再加入乙腈 （乳粉）或（米粉）涡旋混匀。离心取上清液，加入正己烷，收集下层溶液，上层溶液再用正己烷萃取一次。合并下层溶液，用甲酸溶液稀释，过PTFE针式过滤器（Pall），滤液按照仪器工作条件测定。

1.2 功能饮料

功能饮料样品用甲酸溶液稀释，涡旋混匀后过PTFE针式过滤器（Pall），滤液按照仪器工作条件测定。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

以连续流直接进样的方式将混合

标准溶液注入质谱仪中进行全扫描，以响应值最高的准分子离子为母离子，并优化锥孔电压使母离子响应最佳。再对母离子进行产物离子扫描，选择响应值较高且稳定的子离子作为定量离子和定性离子，并优化碰撞能量使特征子离子响应最佳。优化后的质谱参数见表1。

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 色谱柱

试验比较了ACQUITY UPLC® HSS T3、BEH C18、BEH Shield RP18、BEH HILIC等4种色谱柱的分离效果。根据结果，试验

选择ACQUITY UPLC® HSS T3色谱柱作为固定相。

2.2.2 流动相

试验进一步考察了0.1%甲酸溶液-乙腈、0.1%甲酸溶液-甲醇、0.1%甲酸溶液-含0.1%甲酸的甲醇溶液、10mmol·L−1甲酸铵溶液-甲醇、水-甲醇体系作为流动相时对各氨基酸分离效果的影响。根据结果，

试验选择0.1%甲酸溶液-含0.1%甲酸的甲醇溶液体系作为流动相。

在优化的仪器工作条件下，20种氨基酸的提取离子色谱图见图1。

2.3 样品前处理条件的优化

2.3.1 乳粉、米粉样品

功能食品基质较为复杂，可能含有蛋白质、脂肪、碳水化合物、色素等干扰物质，影响氨基酸的准确测定。试验采用蛋白质含量较高的全脂奶粉为基质，添加Gly 1500mg·kg−1、其余19种氨基酸15.0mg·kg−1，分别采用亚铁氰化钾-乙酸锌溶液、亚铁氰化钾-硫酸锌溶液、15%三氯乙酸溶液、50%乙腈溶液等4种沉淀剂去除基质干扰，并将沉淀后的样品溶液稀释10倍后过滤测定，结果见图2。

结果表明：4种沉淀剂去除基质干扰的效果无明显差异，个别氨基酸的回收率较低。考虑到以上4种沉淀剂对蛋白质的沉淀效果较好但对糖类化合物、脂肪等的去除效果有限，且非挥发性锌盐可能影响质谱检测，试验以加标全脂奶粉为待测对象，进一步比较了分别以15%三氯乙酸溶液和50%乙腈溶液沉淀后直接过滤测定（简称萃取前），稀释10倍后过滤测定（简称萃取前稀释10倍），正己烷萃取后过滤测定（简称萃取后），正己烷萃取后稀释10倍并过滤测定（简称萃取后稀释10倍）、正己烷萃取后过固相萃取（SPE）柱并过滤测定（简称萃取后SPE净化）、正己烷萃取后超滤并测定（简称萃取后超滤），各种净化方式所得的各氨基酸的回收率见图3。

结果表明：相较其他净化方式，萃取后稀释10倍所得的各氨基酸的回收率分布较窄，其中以50%乙腈溶液作为沉淀剂的各氨基酸的回收率更优（100%附近），说明50%乙腈溶液净化+正己烷萃取+10倍稀释的净化方式可有效去除样品中蛋白质、脂肪等的基质干扰。因此，试验选择该净化方式去除乳粉、米粉样品的基质干扰。

采用正己烷萃取并进行10倍稀释后的样品溶液中仍可能存在小粒径颗粒物，直接进样容易损坏进样器并阻塞柱头，因此试验选择过滤后测定，并比较了分别以不同品牌CNW、Merck、Pall的PTFE或聚丙烯（GHP）针式过滤器过滤时含 Gly 10mg·L−1、其余19种氨基酸200μg·L−1混合标准溶液中20种氨基酸的回收率，结果见图4。

结果显示：PTFE针式过滤器（CNW）、PTFE 针式过滤器（Merck）、PTFE针式过滤器（Pall）、GHP针式过滤器（Pall）所得的20种氨基酸的回收率依次为83.5%~101%、86.0%~106%、97.2%~107%、81.6%~107%，因此试验选择对20种氨基酸吸附最小的PTFE针式过滤器（Pall）进行过滤。

2.3.2 功能饮料

功能饮料样品的基质虽然较为简单，但是直接测定可能造成一定影响。试验以多肽型、维生素、运动型饮料加标样品为待测对象，比较了稀释100倍后超滤测定以及稀释1000 倍后直接测定（分别简称多肽型饮料稀释100倍超滤、多肽型饮料稀释1000倍、维生素饮料稀释100倍超滤、维生素饮料稀释1000倍、运动型饮料稀释100倍超滤、运动型饮料稀释1000倍）所得的各氨基酸的回收率，结果见图5。

结果显示，将多肽型和运动型功能饮料直接稀释100倍后超滤测定所得的L-Lys和His的回收率均在70.0%以下，而稀释1000倍后直接测定所得的3种功能饮料中20种氨基酸的回收率均较优，因此试验选择将样品稀释1000倍的方式来降低功能饮料基质对测定的影响。

2.4 基质效应

乳粉中存在的蛋白质、脂肪等干扰物质，易引起基质效应（ME），影响检测结果的准确度。分别用空白全脂奶粉样品溶液、0.1%甲酸溶液作为稀释剂配制混合标准溶液系列，按照仪器工作条件测定，分别绘制工作曲线与标准曲线，并计算ME值，结果见表2。当ME值为负值时表示存在基质抑制效应，为正值时表示存在基质增强效应；当ME值绝对值大于50%时表示存在强基质效应，在（20%，50%]内时表示存在中等强度的基质效应，不大于20%时表示基质效应较低，可忽略不计。

结果表明，全脂奶粉中20种氨基酸的ME值绝对值均小于20%，说明基质效应不明显，可以采用溶剂配制混合标准溶液系列。

2.5 标准曲线、检出限和测定下限

按照仪器工作条件测定混合标准溶液系列，以氨基酸的质量浓度为横坐标，对应的定量离子峰面积为纵坐标绘制标准曲线，线性范围、线性回归方程和相关系数见表3。

以3，10倍信噪比 (S/N) 计算检出限（3S/N）和测定下限（10S/N），结果见表3。

2.6 精密度和回收试验

按照试验方法对全脂奶粉、乳蛋白深度水解配方食品、米粉、多肽型饮料、维生素饮料，以及运动型饮料等6种样品进行3个浓度水平的加标回收试验，每个浓度水平平行测定6次，计算回收率和测定值的相对标准偏差（RSD），结果见表4。

结果表明，20种氨基酸的回收率为78.4%~ 136%，测定值的RSD 为0.10%~14%，说明方法的准确度和精密度良好，基本满足分析要求。

2.7 样品分析

按照试验方法分析市售常见的8种功能食品，结果见表5。

结果显示，在8种功能食品中均未检出Cys，其余氨基酸均有不同程度检出。氨基酸配方食品和氨基酸代谢障碍配方食品中氨基酸总含量最高，米粉和其余乳粉次之，运动饮料中含量最低。

3 试验结论

研究人员通过优化前处理条件、色谱条件和质谱条件，提出了超高效液相色谱-串联质谱法定量检测功能食品中20种天然氨基酸的方法。该方法无需衍生化处理，前处理简单便捷，分析时间短，准确度和灵敏度较高，适用于功能食品中20种天然氨基酸的定量分析，可用于特殊人群配方食品的开发和监管。