背景

随着市场需求多样化，用于中胚层美塑疗法的透明质酸钠溶液产品开始添加多种功效成分，其中氨基酸和维生素可提升注射效果。根据国家药品监督管理局医疗器械审评中心要求，生产企业和监察机构要对产品添加成分进行质量控制，确保医美注射用透明质酸钠溶液的安全性、有效性。本文主要针对氨基酸成分展开系统测定。

目前用于氨基酸含量分析的方法多种多样，其中氨基酸分析仪和色谱仪可同时测定多种氨基酸且准确度和灵敏度较高。氨基酸分析仪价格较高，专用性较强；高效液相色谱仪普适性较高，可被用于同时分析食品、药品等样品中的多种氨基酸，实验室常规高效液相色谱仪会配置紫外或荧光检测器，多数氨基酸需衍生化处理后才能在紫外或荧光检测器上获得检测信号。因此，开发一种低成本、高灵敏度、强专属性且操作简单的方法至关重要。

基于此，爱美客技术发展股份有限公司的王素慧、何双江、徐青斌、王颜、陈雄伟等学者发表了一篇题为《医美注射用透明质酸钠溶液中氨基酸含量测定》的研究论文，本文通过优化前处理和仪器检测条件，建立了一种用柱前衍生—高效液相色谱—紫外法测定医美注射用透明质酸钠溶液中氨基酸含量的方法。该方法的专属性、回收率、精密度和灵敏度均符合《中华人民共和国药典》（2020 年版）第四部通则9101分析方法验证指导原则的相关检测要求。

1、方法

1.1 检测方法

1.1.1 色谱条件

    色谱柱为Eclipse Plus C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm），流动相为0.1moL/L 醋酸钠溶液（用稀醋酸将pH调至6.5，A液）—乙腈（B液），梯度洗脱，流速1.0mL/min，柱温40℃，检测波长360nm。具体如表1所示。

1.1.2 溶液的制备

供试品溶液：取2mL供试品置于试管中。

对照品贮备液：分别精密称取甘氨酸对照品10.97mg、丙氨酸对照品10.07mg、脯氨酸对照品20.84 mg、谷氨酸对照品10.45mg、羟脯氨酸对照品11.57mg、天冬酰胺对照品11.04 mg，置于10mL容量瓶，以纯化水稀释，定容摇匀。

对照品溶液：精密量取1mL对照品贮备液，置于10mL量瓶，用水稀释定容摇匀后取2mL置于试管。

阴性对照溶液：依注射用透明质酸钠复合溶液处方及工艺制备不含氨基酸的样品，取2mL置于试管。

空白溶液：取2mL纯化水置于试管。

0.5mol/L NaHCO₃溶液：称8.40g NaHCO₃，加纯化水定容至200mL摇匀备用。

1%的2，4-二硝基氟苯乙腈溶液：量取1mL 2,4-二硝基氟苯，加99mL乙腈摇匀待用。

1.1.3 衍生方法

    向空白溶液、阴性对照溶液、对照品溶液、供试品溶液中，各加入2mL 0.5mol/L NaHCO₃溶液与2mL 1%的2,4-二硝基氟苯乙腈溶液，混匀后于60℃水浴反应50min，冷却，转移至25mL容量瓶，用磷酸盐缓冲液（pH7.0）稀释定容并摇匀。

1.2 方法学考察

1.2.1 系统适用性

取“1.1.2”对照品溶液，精密量取20μL，依“1.1.1”色谱条件，参照《中华人民共和国药典》（2020版）四部通则0512高效液相色谱法试验，连续进样6次并记录色谱图，分别计算谷氨酸、羟脯氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸峰面积的SRSD（%）。

1.2.2 专属性

取“1.1.2”制备的空白溶液、阴性对照溶液、对照品溶液、供试品溶液，其中，供试品1由注射用透明质酸钠复合溶液制得，供试品2由含6种氨基酸自配溶液制得，按“1.1.1”色谱条件进样测定。

1.2.3 线性与范围

精密量取“1.1.2”对照品贮备液0.5、0.75、1、1.25、1.5mL，置于10ml量瓶中，用水稀释至刻度摇匀；各取2mL置于试管中，按“1.1.3”衍生方法制备溶液，取上述对照组溶液各20μL按“1.1.1”色谱条件进样测定并绘制线性关系图。

1.2.4 重复性

取含6种氨基酸自配溶液作供试品，按“1.1.2”方法平行制备6份，各取20μL按“1.1.1”色谱条件进样测定，并计算SRSD。

1.2.5 准确度

按注射用透明质酸钠复合溶液处方及工艺制备不含氨基酸的样品作为阴性对照溶液，取1.8mL分别加入“1.1.2”对照品贮备液0.2mL，充分混匀。平行制备6份，各取20μL按“1.1.1”色谱条件分别进行进样测定，并计算SRSD。

1.3 氨基酸含量测定

精密量取1.8mL阴性透明质酸钠溶液，加入0.2mL 6种氨基酸混合溶液（甘氨酸1mg/mL、丙氨酸1mg/mL、脯氨酸2mg/mL、谷氨酸1mg/mL、羟脯氨酸1mg/mL、天冬酰胺1mg/mL），平行制备3份，得三批自配溶液（PG20230301、PG20230302、PG20230303）。取此3批次自配溶液与5批次注射用透明质酸钠复合溶液（PG20240109、PG20220101、PG20210301、PG20201209、PG20201002），依“1.1.2”供试品溶液的方法制备样品溶液，按“1.1.1”色谱条件测定并计算氨基酸含量。

2、结果

2.1 系统适用性

谷氨酸、羟脯氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸的SRSD分别为0.85%、0.13%、0.12%、0.15%、0.42%、1.68%。可见，各氨基酸的SRSD均小于2%，表明仪器进样重复性好。

2.2 专属性

医美注射用透明质酸钠溶液中，其他成分不干扰6种氨基酸的检测，且各氨基酸与相邻峰的分离度均大于1.5，分离度好，表明该方法专属性良好。具体结果如图1和表2所示。

2.3 线性与范围

研究发现，谷氨酸、羟脯氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸酸的质量浓度为0.05～0.15mg/mL时，质量浓度与峰面积线性关系良好；脯氨酸的质量浓度为0.10～0.30mg/mL时，质量浓度与峰面积线性关系良好。具体结果如图2和表2所示。

2.4 重复性

所有氨基酸检测结果SRSD均小于2%，表明该方法重复性良好。具体结果如表2所示。

2.5 准确度

所有氨基酸检测回收率在90%～110%范围内，结果表明方法准确度良好。具体如表2所示。

2.6 氨基酸含量测定

医美注射用透明质酸钠溶液的各氨基酸含量均在98%～108%范围内，如表3所示。

3、总结

实验结果表明，用本文的方法测定医美注射用透明质酸钠溶液中谷氨酸、羟脯氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸这6种氨基酸的含量，具有操作简便、准确度高、精密度佳的特点。在考察的氨基酸色谱峰与试样中，其他组分的色谱峰峰可实现基线分离，且分离度与峰型良好，此方法可用于医美注射用透明质酸钠溶液的氨基酸含量测定方法。