食品在加工或存储过程中，其中的糖类会因温度的改变而与氨基酸或蛋白质发生美拉德反应，生成醛类化合物。一些醛类化合物具有增色增香或改善食物特色风味的功能；但一些糠醛类化合物会对人产生健康威胁，如食品中含有戊糖时，受热时将产生5-羟甲基糠醛。据报道，糠醛类化合物普遍存在于热加工处理后的食品中，如咖啡。咖啡中含有还原糖，在长时间的热加工后极易产生糠醛类化合物，包括糠醛、5-甲基糠醛、5-羟甲基糠醛等，其中5-羟甲基糠醛对上呼吸道黏膜等具有一定刺激作用。欧盟食品安全局的研究报告给出了这3种糠醛类化合物的每日参考摄入量，但目前我国尚无相关限量标准要求。在我国咖啡消费量大幅持续增加的趋势下，监测咖啡饮品中的糠醛类化合物含量对于保障食品安全具有重要意义，因此有必要开发咖啡饮品中糠醛类化合物的检测方法。

目前，已报道的食品中糠醛类化合物的检测方法有分光光度法、高效液相色谱法、气相色谱 -质谱法等，其中气相色谱 -质谱法具有灵敏度高、分离效果好等优点。相关前处理方法有固相萃取法、固相微萃取法、液液萃取法、液液微萃取法、QuEChERS等，但都有不足。研究人员综合考虑各前处理方法的特点，拟采用碳酸钠去除酸性杂质，乙醇溶液提取，乙腈液液萃取置换，组合填料净化，气相色谱-质谱法检测，内标法定量分析糠醛、5-甲基糠醛、5-羟甲基糠醛等3种糠醛类化合物，并将该方法应用于 4类常见咖啡饮品咖啡豆 (粉 )、纯速溶咖啡、多合一速溶咖啡和咖啡饮料的分析。

1 试验部分

试验样品覆盖了安徽省16种地市线下和线上常见类别国产品牌咖啡饮品，共 32份，其中样品1#~5#为纯速溶咖啡，6#~8#为咖啡饮料，9#~19#为咖啡豆（粉），20#~32#为多合一（包括二合一、三合一、四合一等，均简称多合一）速溶咖啡。在进行样品处理前，咖啡豆先用中药粉碎机或研磨机充分粉碎后装在离心管中，在阴凉处保存；咖啡粉样品直接称量测定；速溶咖啡如果呈颗粒状，需要先用中药粉碎机粉碎再取样测定；咖啡饮料需要先充分混匀再取样测定。

试验方法

提取

1）咖啡豆（粉）　称取咖啡豆（粉）样品，加入乙醇溶液和碳酸钠溶液超声，冷却后用水定容，过滤，收集滤液至离心管内，备用。

2）纯速溶咖啡　称取纯速溶咖啡，加入乙醇溶液和碳酸钠溶液，超声，冷却后用水定容，过滤，收集滤液至离心管内，备用。

3）多合一速溶咖啡　称取多合一速溶咖啡，加入乙醇溶液和碳酸钠溶液，超声，冷却后用水定容，混匀备用。

4）咖啡饮料  取咖啡饮料，加入乙醇溶液和碳酸钠溶液，超声混匀，冷却后用水定容，混匀备用。

液液萃取置换、净化和测定

取上述样品溶液 置于离心管中，加入 乙腈和混合内标溶液，充分混匀后涡旋，离心。取上清液置 于QuEChERS净化管中，涡旋混合，离心，上清液按照仪器工作条件测定。当测定值超出线性范围时，需适当减小称样量后再测定。不加样品，同法进行试剂空白试验，并扣除试剂本底。

2 结果与讨论

2.1 试验条件的优化

2.1.1 色谱条件

试验比较了规格相同的HP-FFAP、DB-WAX、HP-INNOWAX色谱柱的分离效果。结果显示，3种糠醛类化合物在 HP-INNOWAX色谱柱上的峰形均较好，但是5-羟甲基糠醛在HP-FFAP色谱柱以及DB-WAX色谱柱上存在拖尾现象，因此试验选择采用HP-INNOWAX色谱柱作为固定相。

采用HP-INNOWAX色谱柱分离时，混合标准溶液和样品色谱图中糠醛类化合物峰前均存在一个强杂质峰；样品色谱图中5-甲基糠醛峰后普遍存在一个强杂质峰，可能会对5-甲基糠醛定性产生干扰。为解决上述问题同时兼顾分析效率，试验设定了一个较低的初始柱温（50℃），并采用梯度升温条件分离目标物和杂质。

2.1.2 提取条件

糠醛类化合物具有一定极性，可溶于无水乙醇、无水乙醚、丙酮等溶剂，因此试验考察了提取溶剂分别为水、无水乙醇、50%乙醇溶液、无水乙醚、体积比1∶1的无水乙醚-石油醚混合溶液、丙酮、乙腈时对咖啡豆粉样品中3种糠醛类化合物峰面积的影响，结果见图1。

根据试验结果，考虑到无水乙醚不易购买且刺激性较强以及乙腈提取后上机溶液中有较多干扰性杂质，试验选择50% 乙醇溶液作为提取溶剂。

咖啡中含有有机酸等酸性杂质，提取时以pH 12的碱性溶液处理有利于去除酸性杂质，因此试验比较了10%氨水溶液、10%碳酸钠溶液、1%氢氧化钠溶液、饱和氢氧化钙溶液对咖啡豆（粉）样品的处理效果，结果见图2。

根据结果，试验选择10%碳酸钠溶液作为碱性处理剂。

2.1.3 置换溶剂

样品提取液是水溶液且含有部分杂质，可能对气相色谱柱产生一定损伤，因此需进行液液萃取以置换溶剂。试验比较了分别以乙腈、丙酮、乙酸乙酯、无水乙醚、苯、正己烷作为置换溶剂时对加标咖啡豆粉样品中3种糠醛类化合物回收率的影响，结果见图3。

结果显示，以上6种溶剂均可用于置换样品提取液中的目标物，但是乙腈和苯的置换效率较高。考虑到苯有一定危害性，试验选择乙腈作为置换溶剂。

2.1.4 净化填料

采用单一QuEChERS填料 (C18、GCB、PSA或SCX) 净化后发现，干扰峰信号强度降低但仍然存在。试验进一步比较了分别以组合填 料100mgC18+50mgSCX、100mgC18+50mgPSA、400mgGCB+60mgPSA、50mgC18+50mgGCB+50mgPSA净化时对加标咖啡豆粉样品中3种糠醛类化合物回收率的影响，每种组合填料均重复测定 3次，结果见图4。

根据试验结果，考虑到以100mgC18+50mgSCX净化时，3种糠醛类化合物的回收率均较优，试验选择该组合填料进行净化。

2.2 方法学定性验证

以保留时间和定性离子的相对丰度进行定性。相较标准品，样品中目标物的保留时间相对偏差的绝对值应不大于5.0%，定性离子的相对丰度在>50%，>20%~50%，>10%~20%，≤10%时的允许偏差的绝对值应不超过10%，20%，30%，50%。在优化的仪器工作条件下，含内标的混合标准溶液的总离子流色谱图见图5。

2.3 方法学定量验证

2.3.1 标准曲线、检出限和测定下限

取7个进样瓶，分别加入10.0，20.0，50.0，100.0，200.0μL糠醛类化合物混合标准使用液以及100.0，400.0μL糠醛类化合物混合标准中间液，再分别加入混合内标溶液，用乙腈定容并按照仪器工作条件测定。以各糠醛类化合物和对应内标的质量浓度比值为横坐标，定量离子峰面积比值为纵坐标绘制标准曲线。结果显示，糠 醛、5-甲基糠醛和5-羟甲基糠醛的线性范围均为0.050~9.92mg·L−1，线性回归方程分别为y=0.5521x+0.02020、y=0.4315x+0.02300 和y=0.2138x+0.02690，相关系数分别为0.9998，0.9996，0.9997。

取提取的咖啡豆粉样品溶液，用水稀释制成咖啡豆粉样品稀释液，再用乙腈将咖啡豆粉样品稀释液稀释 2，4倍，重复测定上述两种样品的乙腈稀释液各3次并计算平均信噪比。以不小于3，10的信噪比分别估算检出限和测定下限，糠醛、5-甲基糠醛和5-羟甲基糠醛的检出限分别为 0.002，0.002，0.003mg·kg−1，测定下限分别为0.006，0.006，0.010mg·kg−1。

2.3.2 精密度和回收试验

4类咖啡饮品中均含有糠醛类化合物，选择目标物含量较低的咖啡豆粉样品进行两个浓度水平的加标回收试验，每个浓度水平平行测定6次，计算回收率和测定值的相对标准偏差（RSD），结果见表1。

表1 精密度和回收试验结果（n=6）

结果显示，两个浓度水平下3种糠醛类化合物的回收率为94.0%~107%，测定值的RSD为0.70%~ 2.2%。加标量为1.50mg·L−1的咖啡豆样品溶液的总离子流色谱图见图6。

2.4 样品分析

为了验证方法的适用性，按照试验方法分析32份咖啡饮品，结果见表2。

表2 样品分析结果

结果显示，在32份样品中均检出了3种糠醛类化合物。咖啡豆（粉）可用于制备其他咖啡饮品，其中糠醛、5-甲基糠醛含量整体高于其他类型咖啡饮品中的，5-羟甲基糠醛含量也较高且波动较大；纯速溶咖啡中 3种糠醛类化合物总含量整体较高，且5-羟甲基糠醛含量占比最高，该研究结果和国外相关研究一致，这是由于纯速溶咖啡中部分5-羟甲基糠醛来源于咖啡豆（粉）中糠醛的转化，部分来源于热加工过程转化。考虑到我国暂无对于咖啡饮品中糠醛类化合物限量的相关标准，而近年来我国人均咖啡摄入量增长较快，需进一步加强对咖啡饮品中5-羟甲基糠醛带来的健康风险的监测。

3 试验结论

研究人员在碱性条件下以50%乙醇溶液提取，乙腈液液萃取置换，组合填料净化，气相色谱-质谱法检测，内标法定量分析4种类型咖啡饮品中的糠醛、5-甲基糠醛、5-羟甲基糠醛。该方法操作便捷，灵敏度、准确度和精密度较好，可为咖啡饮品中糠醛类化合物的检测提供较为实用的高灵敏度检测方法。