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热景生物研发乙型肝炎病毒RNA(HBV-RNA)测定试剂盒(PCR-荧光探针法)做了哪些研发实验

嘉峪检测网        2022-11-17 20:37

本文主要介绍了北京热景生物技术股份有限公司研发的医疗器械“乙型肝炎病毒 RNA(HBV-RNA)测定试剂盒(PCR-荧光探针法)”的临床前研发实验。

 

一、乙型肝炎病毒 RNA(HBV-RNA)测定试剂盒(PCR-荧光探针法)产品的主要组成成分

 

本试剂盒由A盒(磁珠法核酸提取试剂)和B盒(扩增反应试剂)组成,主要组成成分见表1。

 

表1 试剂盒主要组成成分

热景生物研发乙型肝炎病毒RNA(HBV-RNA)测定试剂盒(PCR-荧光探针法)做了哪些研发实验

热景生物研发乙型肝炎病毒RNA(HBV-RNA)测定试剂盒(PCR-荧光探针法)做了哪些研发实验

 

具体内容详见产品说明书。 

 

二、乙型肝炎病毒 RNA(HBV-RNA)测定试剂盒(PCR-荧光探针法)产品的预期用途

 

本试剂盒用于体外定量测定人血清样本中的乙型肝炎病毒RNA(HBV-RNA)。已有研究数据显示,外周血血清中 HBV-RNA 可反映肝内HBV病毒的转录活性,在部分血清中HBV DNA 低于检测下限的样本中,HBV-RNA 仍可以被检测到。同时,在NAs治疗中,血清HBV-RNA可辅助作为HBeAg转阴的预测的指标之一,血清HBV-RNA结果为阴性,需要结合其他指标共同用于指导NAs的治疗。该检测结果不得作为患者病情评价的唯一指标,必须结合患者临床表现和其他实验室检测对病情进行综合分析。本试剂盒不得用于HBV的血液筛查。

 

三、乙型肝炎病毒 RNA(HBV-RNA)测定试剂盒(PCR-荧光探针法)产品的产品包装规格 

 

48人份/盒。

 

四、乙型肝炎病毒 RNA(HBV-RNA)测定试剂盒(PCR-荧光探针法)产品的检验原理

 

本试剂盒(PCR-荧光探针法)采用磁珠法提取血清中的HBV-RNA。特异性地检测 HBV-RNA的保守区域。检测试剂内含有一条反转录引物、一对特异性扩增引物以及一条荧光探针,与RT-PCR反应缓冲液,Taq酶,逆转录酶等共同配制成RT-PCR反应液,在实时荧光定量 PCR 仪上进行一步法RT-PCR扩增,实现对血清样本中 HBV-RNA的检测。

 

五、乙型肝炎病毒 RNA(HBV-RNA)测定试剂盒(PCR-荧光探针法)产品的主要原材料的选择

 

本产品的主要原材料包括:引物、探针、假病毒、RT PCR反应体系(包括10×RT-PCR Buffer(含dNTPs)、逆转录酶和TaqDNA聚合酶混合液)、磁珠法核酸提取试剂等,这些原材料均是通过外购方式获得。其中,引物和探针均为热景生物自行设计,由专业的合成公司合成和纯化后获得。 

热景生物从有资质的供应商中,通过功能性试验,筛选出最佳原材料和供应商。制定了各主要原材料质量标准并经检验合格。

 

六、乙型肝炎病毒 RNA(HBV-RNA)测定试剂盒(PCR-荧光探针法)产品的企业参考品设置情况

 

该产品企业参考品包括阳性参考品、阴性参考品、精密度参考品、检出限参考品、准确度参考品、样本线性参考品、核酸提取功能参考品,参考品采用临床样本制备而成。

组成如下:

阳性参考品共10份,分别命名为阳性参考品P1~P10,来源于HBV-RNA阳性样本,涵盖B型、C型和D型。

阴性参考品共10份,分别命名为阴性参考品N1~N10,涵盖正常人样本、巨细胞病毒、EB病毒、人类免疫缺陷病毒1型、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和梅毒样本。

精密度参考品共2份,分别命名为精密度参考品J1~J2,采用HBV-RNA阳性样本梯度稀释而成。

检出限参考品1份,命名为检出限参考品S1,采用HBV RNA阳性样本稀释而成,浓度为300copies/mL 。

准确度参考品共5份,分别命名为准确度参考品Y1~Y5,采用HBV-RNA阳性样本梯度稀释而成,浓度分别为2.0×107 copies/mL、2.0×106 copies/mL、2.0×105 copies/mL、2.0×104 copies/mL、2.0×103 copies/mL。 

样本线性参考品1份,命名为样本线性参考品L,采用HBV-RNA阳性样本稀释而成。

核酸提取功能参考品共 12 份,分别命名为核酸提取功能参考品T1~T12,其中T1~T8采用含内源性干扰物质的HBV RNA阳性样本稀释而成,T1、T5、T9含血红蛋白,T2、T6、T10含甘油三脂,T3、T7、T11含总IgG,T4、T8、T12含总胆红素,T9~T12为阴性血清样本。

以上临床样本采用数字PCR法和实时荧光PCR法进行确认。各企业参考品用于产品准确性、特异性、检出限、精密度、线性、核酸提取功能等的检测。

本试剂盒设置了阳性质控品和阴性质控品,用于检测过程中试剂盒和仪器的质量控制。此外,每个样本均检测1个内标,用于评估核酸提取和PCR扩增的质量和结果的判读。

 

七、乙型肝炎病毒 RNA(HBV-RNA)测定试剂盒(PCR-荧光探针法)产品的生产工艺及反应体系研究 

 

热景生物对试剂盒反应体系的研究包括对HBV-RNA特异性引物/探针浓度的确定、内标引物/探针浓度的确定、反应液的选择、反应体积的确定、核酸提取试剂的确定、DNA酶I的用量确定等;对反应条件的研究包括PCR退火温度、扩增循环数、扩增反应时间,DNA 酶 I 的作用温度和时间的筛选和优化;对样本用量、内标用量、核酸提取液体积等进行了研究。

热景生物通过功能性实验,确定了最佳的反应体系。并根据试剂盒中试剂及组件的主要生产工艺的研究结果,确定了最佳的生产工艺。

 

八、乙型肝炎病毒 RNA(HBV-RNA)测定试剂盒(PCR-荧光探针法)产品的的分析性能评估研究

 

该产品分析性能评估内容包括核酸提取功能、检出限、线性范围、准确度、精密度、分析特异性(交叉反应、干扰物质)、HBV DNA 干扰浓度等。热景生物提交了有效运行的质量管理体系下生产的三批产品在3种适用机型(ABI Prism7500、LightCycler480、杭州博日 9600plus)上的性能评估资料。

在核酸提取功能评估中,热景生物使用含有28mg/dL总胆红素、22g/dL血红蛋白、3000mg/dL甘油三酯、40g/L总IgG的HBV-RNA阴性血清样本稀释已知浓度的HBV-RNA强阳性样本,制备成高、低浓度样本进行研究,结果表明以上干 

扰物质对核酸提取性能无影响。

在检出限的性能评估中,热景生物对HBV-RNA临床血清样本(B型、C型、D型)和HBV-RNA假病毒样本(A型、E型、F型、G型)进行梯度稀释,采用三批次试剂对系列浓度样本分别进行20次重复检测,以≥95%阳性检出率的最低稀释浓度作为检出限,最终确定该产品检出限为300copies/mL。采用三批试剂对HBV-RNA临床血清样本(B型、C型、D型)和HBV-RNA假病毒样本(A型、E型、F型、G型)进行检出限的重复性检测验证,符合检出限的性能要求。

在线性范围的性能评估中,热景生物采用不同基因型的样本,分别制备9个浓度的样本进行线性范围研究,产品在1.0×103 copies/mL~1.0×108 copies/mL范围浓度呈线性相关,线性相关系数 r>0.9800,符合线性范围的性能要求。

在准确度的性能评估中,热景生物采用 HBV-RNA 阴性样本 

对阳性样本进行系列稀释,分别制备成2.0×107 copies/mL、2.0 × 106 copies/mL、2.0 × 105 copies/mL、2.0 × 104 copies/mL、2.0×103 copies/mL共5个梯度样本进行准确度研究,结果表明检测浓度的对数值与理论浓度的对数值的绝对偏差不超过±0.5 个对数数量级,符合准确度的性能要求。

在精密度的性能评估中,热景生物对高、中2个浓度的HBV RNA精密度样本进行检测,分别对批内、批间检测结果进行分析,结果表明精密度样本的变异系数均不高于5%,符合精密度的性能要求。

分析特异性研究包含交叉反应和干扰研究。交叉反应的性能评估中,热景生物对人巨细胞病毒、EB 病毒、人类免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、梅毒、人类疱疹病毒 6 型、单纯疱疹病毒 1 型、单纯疱疹病毒 2 型、甲型流 

感病毒、丙酸痤疮杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌样本进行交叉反应评价。结果显示,上述样本与本产品均不产生交叉反应。

干扰研究实验中,热景生物采用在中低浓度的 HBV-RNA 样 本中加入干扰物质的方法进行验证,拉米夫定(1.3μg/mL)、 阿德福韦酯(21.24ng/mL)、恩替卡韦(3.46μg/mL)、替比夫定(3.69μg/mL)、普通 IFNα(2020pg/mL)、聚乙二醇干扰素α(10.88μg/L)、总胆红素(≤28mg/dL)、甘油三酯(≤3000mg/dL)、血红蛋白(≤22g/dL)、总 IgG(≤40g/L)及不高于 2×107 IU/mL 的 HBV DNA 对本产品检测结果均不产生干扰。

 

九、乙型肝炎病毒 RNA(HBV-RNA)测定试剂盒(PCR-荧光探针法)产品的阳性判断值或参考区间研究

 

本产品的阳性判断值研究,采用乙肝感染者的血清样本(B 型、C 型、D 型)及不同人的阴性血清样本共 249 例,使用本试剂盒进行阳性判断值研究,对检测靶标 Ct 值进行ROC 分析,确定其阳性判断值为靶标 Ct≤26。通过对 HBV DNA 阳性/阴性、HBsAg 阳性/阴性及 HBeAg 阳性/阴性样本的 靶标进行 Ct 值分析,HBV DNA 阳性/阴性、HBsAg 阳性/阴性 及 HBeAg 阳性/阴性对靶标阳性判断值的判定无影响。

本产品预测HBeAg转阴的阳性判断值研究,采用79例慢性HBV感染者(B型、C型、D型)队列血清样本(0周、48周、5年),使用本试剂盒进行检测,对检测结果分别计算 B、C、D 型的 ROC 曲线和最佳预测 cutoff 值,结果显示 

均不具有显著差异;将 B 型、C 型、D 型样本合并共同用于确定预测治疗 5 年后 e 抗原转阴的最佳 cutoff 值为708copies/mL。此时的 PPV 为 81.8%,NPV 为 87.0%。

 

十、乙型肝炎病毒 RNA(HBV-RNA)测定试剂盒(PCR-荧光探针法)产品的稳定性研究

 

热景生物对本产品的实时稳定性、开瓶及冻融次数限度稳定性、运输稳定性进行了研究,同时,对样本的稳定性也进行了研究,确定了在各种条件下本产品及样本的有效保存时间。

实时稳定性:将三批次试剂的 A 盒置于 10~30℃,B 盒置于-20 ± 5℃的条件下保存,连续 7 个月对试剂盒的外观、阴阳性符合率、检出限、线性、准确度、精密度进行考察,各项性能指标均符合要求,确定产品在规定的储存条件 下,可稳定保存 6 个月。 

此外,热景生物对产品的开瓶及冻融次数限度稳定性、运输稳定性和样本稳定性分别进行了研究。结果显示,产品的性能均满足产品说明书声称的要求。

 
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来源:嘉峪检测网