近年来，随着分子诊断技术的升级迭代，分子诊断的临床应用也越来越广泛，分子诊断市场进入了快速发展期。PCR是使用最为广泛的核酸扩增技术，以其灵敏性、特异性而被广泛应用，然而PCR需要反复的热变性，无法摆脱依赖仪器设备的局限，从而限制了其在临床现场检测中的应用。自20世纪90年代以来，很多实验室开始发展无需热变性的恒温扩增技术。现已开发出环介导等温扩增技术、链替代等温扩增技术、滚环等温扩增技术、依赖核酸序列等温扩增技术等技术。本文将带读者共同揭开等温扩增应用最广泛的技术——LAMP的“神秘面纱”。

- 01 -LAMP基本介绍

2000年日本学者Notomi博士在Nucleic Acids Res杂志上公开了一种新的适用于基因诊断的恒温核酸扩增技术，即环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）。LAMP技术的横空出世，受到了来自世卫组织WHO、各国学者和相关政府部门的关注，短短几年，该技术已成功地应用于SARS、禽流感、HIV等疾病的检测中，在2009年甲型H1N1流感事件中，日本荣研化学株式会社（以下简称“荣研公司”）接受WHO的邀请完成了H1N1环介导等温扩增法检测试剂盒的研制，通过早期快速诊断对防止该病症的快速蔓延起到积极作用。

LAMP针对6个位点使用4-6条引物（普通PCR使用2条引物），因此基因组序列上的多个区域可作为特异性的靶标。相比大多数基于普通PCR的检测方法，这种DNA合成起始点的增加使得检测特异性和灵敏度得到增强。当合成开始后，引物对形成环状结构，加速后续的扩增。

LAMP中常使用的酶是Bsm DNA polymerase，其来源于Bacillus smithii聚合酶的一部分，等同于Bst DNA polymerase大片段。Bsm具有强链置换活性，最佳反应温度为60°C。这种酶的扩增效率非常高，在15分钟内即可进行十亿倍的扩增。同时其高度耐受复杂样本中的抑制剂，所以可对植物组织、血液、尿液和口腔拭子等样本进行检测。

LAMP反应会产生副产物焦磷酸镁，其从溶液中沉淀出来，使溶液变得浑浊。可以通过浊度分析或染料来监测反应。羟基萘酚蓝（HNB）会由紫色变为蓝色。钙黄绿素，当镁离子存在时，经锰淬火，由橙色变为黄绿色。SYBR Green、EvaGreen® (Biotium)和berberine为核酸特异性染料，在紫外光下可发射荧光信号。通过比色检测简单快速，但不能提供准确定量。可根据检测需求，选用最佳的检测方法[1]。

表1. LAMP和PCR技术的比较

- 02 -LAMP等温扩增原理

最初LAMP反应是针对靶标的六个区域（F3、F2、F1、B1、B2、B3）设计四条引物，包括一对外引物（F3&B3）和一对内引物（FIP&BIP）。其扩增原理是基于DNA在65℃左右处于动态平衡状态，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。DNA在此温度下利用4条特异性引物依靠一种链置换DNA聚合酶，使链置换DNA的合成不停地自我循环。先确定目标基因上的6个特异性区域F3、F2、F1、B1、B2、B3，然后依据这6 个特异性区域设计4条引物：

▸正向内引物(forwardinner primer，FIP)，由F1c 和F2 组成。

▸反向内引物(backwardinner primer，BIP)，由B1c 和B2 组成，中间均以TTTT作为间隔。

▸外引物F3、B3 分别由目的基因上的F3、B3 区域组成。

在LAMP 反应体系中，内引物的浓度是外引物浓度的几倍。内引物先与模板链结合合成互补链，形成DNA双链。随后外引物再与该模板链结合，形成DNA双链，在Bst DNA 聚合酶的作用下，释放出由内引物合成的互补链，该互补链经过一系列反应最终形成具有哑铃结构的DNA单链。以哑铃结构DNA单链自身为模板不断形成一端开口的过渡性茎环结构DNA，由内外引物引导过渡性茎环结构DNA不断发生链置换延伸反应，最后形成具有多个茎环结构的长度不一的DNA混合物。

图1.  LAMP扩增原理

- 03 -LAMP引物设计原则

根据前文提及，LAMP引物一般有4-6条（包含环引物的存在）。引物设计时主要需要考虑三个因素：长度，Tm值，间距。一般采用Bst酶的LAMP默认引物参数如下表格：

表2. LAMP引物设计参数

需要注意的是当采用LavaLAMPTM体系时，默认Tm值需要提高6℃。

除此之外，LAMP引物设计还需遵从以下原则：

① 一般GC含量为40-60%；

② 靶标序列长度≤280bp；

③ 避免引物中单碱基或双碱基重复3次以上（如ACCC，ATATAT），减少引物二聚体或者非特异性扩增；

④ 引物对应具有相似的Tm值，最大相差不超过5 ℃；

⑤ 避免引物形成二级结构（引物内超过3个碱基互补或引物间具有互补序列）；

⑥ 在进行引物筛选时，引物二聚体ΔG≥-3.5，引物末端ΔG≤-4。

- 04 -LAMP的优势与不足

➢ LAMP 的优势：

（1）扩增效率高，能够在1h内有效的扩增1-10个拷贝的目的基因，扩增效率为普通PCR的10 倍-100 倍。

（2）反应时间短，特异性强，不需要特殊的设备。

➢ LAMP 的不足：

（1）对引物的要求特别高。

（2）扩增产物不能用于克隆测序，只能用于判断。

（3）由于其敏感性强，容易形成气溶胶，造成假阳性，影响检测结果。

- 05 -等温扩增技术汇总

常见的等温扩增技术除了LAMP还有RCA、NASBA等：

表3. 等温扩增技术汇总

- 06 -诺唯赞解决方案

为了满足广大客户开发更多POCT产品的需求，诺唯赞推出了适用于LAMP等温扩增的系列产品。快速聚合的同时（最快可在30min以内），在扩增灵敏度和扩增效率等方面均具有明显提升，同时，Bst II Pro DNA Polymerase Large Fragment（Vazyme#P703）具有更强的特异性，解决了LAMP中常见的NTC起峰问题。

参考文献：

[1]Fischbach J et al. (2018) Shining a light on LAMP assays' A comparison of LAMP visualization methods including the novel use of berberine. BioTechniques 58(4):189-94.