在药品生产、质量保证 (QA) 和质量控制 (QC)过程中，分析测试方法必须遵守国际标准。采用UV/Vis分光光度法进行蛋白定量，是目前最常用的蛋白药物定量方法之一，基本所有制药企业的QC都有不止一套UV/Vis光谱仪/分光光度计，也都非常关注数据合规性，但关于紫外吸收蛋白定量数据准确性验证方法、影响数据准确性的因素 ，以及对正在“服役”的分析仪器是否符合药典性能验证要求，如何验证等问题，相信很多人仍是一头雾水。针对UV/Vis光谱仪作为分析工具的适用性验证，美国药典（USP）42<857>章节和欧洲药典（Ph.Eur.）第2.2.2.25节规定了性能测试方案和验证标准。本文我们就来条分缕析解读药典要求。

首先要清楚，USP 42<857> 和 Ph.Eur.2.2.2.25规定，应对UV/Vis分光光度计在预期用途操作范围内进行吸光度准确性、精确性、线性、波长准确性、分辨率和杂散光验证。然后我们再来解决一堆Why, What, How？

1. 吸光度准确性(absorbance accuracy)

用吸光度值经过认证的标准品 ，对吸光度准确性进行验证，USP要求在0-2A之内，至少验证1个吸光度值；而Ph.Eur.要求对预期吸光度范围上下限值均需验证，可接受偏差应该包含标准品生产不确定性偏差。

2. 吸光度精确性(absorbance precision)

Ph.Eur.第10版第2.2.2.25节对吸光度精确性无要求。USP 42<857>规定，如果标准值小于1A，则6次重复测定值的标准偏差（SD）应等于或小于0.005 A。如果其大于或等于1A，则6次重复的相对标准偏差（RSD）必须小于或等于0.5%

3. 吸光度线性(absorbance linearity)

为满足USP 42<857>的吸光度线性标准，线性吸光度范围内的3个具有不同吸光度水平的CRMs（认证标准物质）必须全部通过准确性和精确性测试。Ph.Eur.第10版第2.2.2.25节关于吸光度线性标准要求2个吸光度水平并且决定系数（R2）大于0.999。

根据USP 42<857>和Ph.Eur.2.2.2.25要求，需使用同一套CRMs对吸光度准确性、精确性和线性进行验证，重铬酸钾（K2Cr2O7）高氯酸（HClO4）溶液是USP和Ph.Eu.推荐的200–400 nm波长范围内UV/Vis分光光度计吸光度性能验证标准品。

UV/Vis分光光度计测定样品在紫外和可见光范围内多波长吸光度，USP和Ph.Eur.规定所有UV/Vis分光光度计，必须验证波长准确性和分辨率。

4. 波长准确性(Wavelength accuracy)

UV/Vis分光光度计的波长准确性是检测仪器报告的波长与认证波长之间的相近程度，可通过测量具有多波长明确峰值且可追溯的CRM吸收光谱，将测量光谱与已知光谱进行比较来确定。

氧化钬高氯酸溶液是一种国际公认的固有波长标准溶液，其吸收峰值在241、287、361、537和641 nm，在USP 42<857>和第10版Ph.Eur. 第2.2.2.25条中均有认定。根据USP和Ph.Eur.指南，200–400 nm之间波长验证标准为偏差在1 nm以内，如果验证波长>400 nm，则偏差在2 nm以内。

5. 波长分辨率(Spectral resolution)

光谱分辨率是指UV/Vis分光光度计正确区分吸收光谱中两个相近波长吸光度的能力，可通过测量甲苯己烷溶液的吸收光谱，并确定最大吸光度（约269 nm）和最小吸光度（约266 nm）之间的比值考察。根据USP和Ph.Eur.标准，该比值不小于1.3。非广告提醒：Big Lunatic每次测量前都会进行波长自动校准，所以可以确保良好的波长准确性和分辨率。

6. 杂散光（Stray light）

杂散光是指由UV/Vis检测器检测到的不属于指定波长的、“来路不明”的光，主要来源为内部镜面反射和二次衍射。杂散光在紫外波段的影响最大，而紫外波段也正是核酸和蛋白质定量的最重要范围。因此USP和Ph.Eur.要求，UV/Vis分光光度计必须确定其杂散光限值。USP推荐采用丙酮对250-330nm波长范围进行杂散检测。Ph.Eur.指定使用碘化钠、碘化钾或亚硝酸钠溶液来测试杂散光，但也允许其他标准物质。由于Ph.Eur.指定的标准溶液并不覆盖核酸和蛋白最大吸收峰（分别为260和280nm），因此丙酮作为杂散光检测参照物更合适。丙酮吸收250-330nm的大部分光，因此，通过UV/Vis分光光度计测量的该范围内的任何光都可能是杂散光。USP验证标准为吸光度大于或等于2A，而Ph.Eur.标准则要求吸光度≥3A(大于3A的吸光度相当于小于0.1%的杂散光)。