摘要  目的： 建立高效液相色谱法测定氨酚伪麻那敏分散片中对氨基酚的含量。方法：采用ZORBAX Eclipse XDB-C8 (4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为磷酸盐缓冲液-甲醇(95:5)；流速1.0 mL·min-1；检测波长230 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。结果：对氨基酚和相邻色谱峰分离度良好，对氨基酚定量限为0.911 4 ng，检测限为0.375 9 ng，在0.102 9～30.87 μg·mL-1浓度范围内线性良好(r=1.000)，回收率为96.8%，RSD为0.4%(n=9)。结论：该方法准确、灵敏，可用于氨酚伪麻那敏分散片中对氨基酚的含量测定。

 

关键词：氨酚伪麻那敏分散片；对氨基酚；高效液相色谱法

 

Determination of p-aminophenol in paracetamol, pseudoephedrine hydrochloride and chlorphenamine maleate dispersible tablets by HPLC

 

JIANG Kun, CHEN Yanqing, CAI Jinxiong, PANG Fagen, LI Yulan, WANG Tiejie

 

(Shenzhen Institute for Drug Control, Shenzhen 518057, China)

 

Abstract  Objective: To establish an HPLC method for the determination of p-aminophenol in pseudoephedrine hydrochloride and chlorphenamine maleate dispersible tablets. Methods: The analysis was performed on a ZORBAX Eclipse XDB-C8 column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) using a mobile phase of phosphate buffer solution-methanol (95：5) delivered at a flow rate of 1.0 mL·min-1. The detection wavelength was set at 230 nm, the column temperature was 30 ℃, and the injection volume was 10 μL. Results: The resolution between p-aminophenol and adjacent chromatographic peak was good. The qualification limit and detection limit of p-aminophenol was 0.9114 ng and 0.375 9 ng, respectively. p-aminophenol showed good linearity in the range of 0.102 9-30.87 μg·mL-1(r=1.000). The average recovery was 96.8% (RSD=0.4%, n=9). Conclusion: The established method showed good accuracy and sensitivity,which could be used for the determination of p-aminophenol in pseudoephedrine hydrochloride and chlorphenamine maleate dispersible tablets.

 

Key words: pseudoephedrine hydrochloride and chlorphenamine maleate dispersible tablets; p-aminophenol; HPLC

 

氨酚伪麻那敏分散片主要用于缓解普通感冒及流行性感冒引起的发热、头痛、四肢酸痛、打喷嚏、流鼻涕、鼻塞、咽痛等症状。也可用于儿童流行性感冒的治疗。其主要成分为对乙酰氨基酚、盐酸伪麻黄碱和马来酸氯苯那敏。对氨基酚是对乙酰氨基酚生产时带入或储存时产生的降解产物，对人体有一定的毒性[1]。《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)2020年版二部对乙酰氨基酚原料药及相关制剂品种严格控制对氨基酚含量，各制剂标准中规定不得过对乙酰氨基酚标示量的0.1%[2]。同时，对含对乙酰氨基酚的各种复方制剂中的对氨基酚进行控制，也成为了近期药品生产和检验领域关注的热点[3-7]。氨酚伪麻那敏分散片现行标准未对对氨基酚进行控制[8-9]，也未见有文献对氨酚伪麻那敏分散片中对氨基酚进行分析测定。鉴于本品中对乙酰氨基酚的用量较大，有必要将对氨基酚作为指标杂质进行检查。本文采用HPLC法对氨酚伪麻那敏分散片中对氨基酚的含量进行了测定，方法专属性强，灵敏、准确，为提高该品种的质量标准提供了合理的依据和参考。

 

1  仪器与试药

 

1.1  仪器

 

高效液相色谱仪(Waters 2695)，二极管阵列检测器(Waters 2998)，电子天平(Mettler Toledo XSE205DU)。

 

1.2  试药

 

对氨基酚对照品(中国食品药品检定研究院，批号100802-201604，纯度100%)，对乙酰氨基酚对照品(中国食品药品检定研究院，批号100018-201610，纯度99.9%)；氨酚伪麻那敏分散片(每片含对乙酰氨基酚80 mg，盐酸伪麻黄碱7.5 mg，马来酸氯苯那敏0.5 mg。共一个厂家，共3个批次)；空白辅料(由生产厂家提供)；甲醇为色谱纯；马来酸、10%四丁基氢氧化铵溶液、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠均为分析纯；水为超纯水。

 

2  方法与结果

 

2.1  色谱条件

 

色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C8 (4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钠8.95 g，磷酸二氢钠3.9 g，加水溶解至1 000 mL，加10%四丁基氢氧化铵溶液16 mL)-甲醇(95:5)；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：230 nm；柱温30 ℃；进样器温度：10 ℃；进样量：10 μL。

 

1.对氨基酚(p-aminophenol)

图1  系统适用性图谱

Fig.1   Chromatography of system suitability

 

2.2  溶液的制备

 

2.2.1  溶剂甲醇-水(5:95)。

 

2.2.2  供试品溶液  取本品细粉适量(约相当于对乙酰氨基酚200 mg)，精密称定，置10 mL量瓶中，加溶剂适量，振摇使溶解，加溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液。

 

2.2.3  对照品溶液  取对氨基酚对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每1 mL中约含20 μg的溶液。

 

2.2.4  对照品浓溶液  取对氨基酚对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每1 mL中约含200 μg的溶液。

 

2.2.5  系统适用性溶液  取对氨基酚对照品和本品细粉各适量，加溶剂溶解并稀释制成每1 mL中约含对氨基酚20 μg和对乙酰氨基酚20 mg的混合溶液，滤过，取续滤液。

 

2.3  专属性试验

 

2.3.1  空白辅料溶液  取空白辅料约0.156 g，置10 mL量瓶中，加溶剂适量，振摇使溶解，加溶剂稀释至刻度，摇匀；滤过。

 

2.3.2  酸破坏溶液  取供试品适量(约相当于对乙酰氨基酚200 mg)，精密称定，置10 mL量瓶中，加入0.2 mol·L-1的盐酸溶液1 mL，放置1 h，加入0.2 mol·L-1的氢氧化钠溶液1 mL，加溶剂适量，振摇使溶解，加溶剂稀释至刻度，摇匀；滤过。

 

2.3.3  碱破坏溶液  取供试品适量(约相当于对乙酰氨基酚200 mg)，精密称定，置10 mL量瓶中，加入0.2 mol·L-1的氢氧化钠溶液1 mL，放置1 h，加入0.2 mol·L-1的盐酸溶液1 mL，加溶剂适量，振摇使溶解，加溶剂稀释至刻度，摇匀；滤过。

 

2.3.4  氧化破坏溶液  取供试品适量(约相当于对乙酰氨基酚200 mg)，精密称定，置10 mL量瓶中，加入过氧化氢溶液(15%)0.5 mL，放置15 min，加溶剂适量，振摇使溶解，加溶剂稀释至刻度，摇匀；滤过。

 

2.3.5  光照破坏溶液  取供试品适量(约相当于对乙酰氨基酚200 mg)，精密称定，置10 mL量瓶中，加溶剂适量，振摇使溶解，加溶剂稀释至刻度，摇匀；滤过。取续滤液3 mL，在4500 lx±500 lx光照强度下照射2 h。

 

取空白溶剂及上述各溶液依法进样，色谱图见图2。结果表明，空白溶剂、辅料对对氨基酚的测定无干扰。在酸、碱、氧化、光照条下破坏样品所产生的杂质峰与对氨基酚峰有良好分离，在该系统下对对氨基酚的测定无干扰。

 

2.4  溶液稳定性试验

 

取对照品溶液，在10 ℃进样器内放置0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h后，按上述色谱条件测定。结果表明，在10 ℃条件下，5 h以内对氨基酚可保持稳定，RSD为0.3%(n=6)。随时间的推移对照品溶液主峰面积减小，对氨基酚有降解。故供试品溶液应在配置好5 h内完成进样分析。

 

2.5  线性和范围

 

称取对氨基酚对照品20.58 mg，置20 mL量瓶中，用溶剂溶解稀释至刻度配制成对氨基酚储备液，逐级稀释成浓度为0.1029、1.029、10.29、20.58、30.87 μg·mL-1的系列溶液，按上述色谱条件进行测定，记录色谱图，以浓度C(μg·mL-1)对峰面积A进行线性拟合。线性方程为：

 

Y=3.808×104X-3 719.9  r=1.000

 

结果表明，对氨基酚在0.102 9~30.87 μg·mL-1浓度范围内线性良好。

 

2.6  检测限和定量限

 

取对照品溶液，用溶剂逐级稀释，按上述色谱条件进行测定，以信噪比为3:1时计算检测限，以信噪比为10:1时计算定量限。结果表明，定量限为0.911 4 ng，检测限为0.375 9 ng。

 

2.7  回收率试验

 

取供试品6份，置10 mL量瓶中，分别精密加入适量的对氨基酚对照品浓溶液适量，配制成相当于100%限度水平的回收率溶液。按上述色谱条件进行测定，计算回收率。平均回收率结果为96.8%，RSD为0.4%(n=6)。见表1。

 

1.对氨基酚(p-aminophenol)  A.空白溶剂(blank solvent)  B. 空白辅料(blank excipients)  C. 酸破坏溶液(decomposed by 0.2 mol·L-1 hydrochloric acid solution)  D. 碱破坏溶液(decomposed by                              0.2 mol·L-1 sodium hydroxide solution)  E. 氧化破坏溶液(decomposed by 15% hydrogen peroxide solution)  F. 光照破坏溶液(decomposed by 4500 lx±500 lx)

图2  专属性试验色谱图

Fig.2   The chromatograms of specificity

 

2.8  重复性试验

 

因三批供试品中对氨基酚含量均低于定量限，故取回收率试验项下溶液测定结果计算重复性，RSD为0.4%。

 

表1  回收率试验结果(n=6)

Tab.1  Results of recovery

 

 

2.9  耐用性试验

 

取供试品溶液和对照品溶液，改变拟定色谱条件，包括有机相比例(97:3、95:5、93:7)，柱温(25 ℃、30 ℃、35 ℃)，更换色谱柱(Kromasil 100 100-5-C8和Symmetry C8)及液相色谱仪(Agilent 1200，Ultimate 3000)，对氨基酚峰与相邻杂质峰均能达到良好的分离，方法的耐用性良好。

 

2.10  含量测定

 

按上述色谱条件进行测定，以外标法按峰面积计算对氨基酚的含量。三批供试品中有两批检出对氨基酚，相当于对乙酰氨基酚标示量0.000 2%和0.000 3%，但含量均低于定量限。

 

3  讨论

 

3.1  流动相和色谱柱的选择

 

当使用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾溶液-三乙胺(20:80:0.02)为流动相时，对氨基酚峰与溶剂峰基线分离，但在进行专属性试验时，经过0.1 mol·L-1 HCl破坏后，对氨基酚和相邻杂质峰分离度不能满足要求。在通过调节有机相和水相比例后，分离度依然不能满足要求。实验又考查了以辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钠8.95 g，磷酸二氢钠3.9 g，加水溶解至1 000 mL，加10%四丁基氢氧化铵溶液16 mL)-甲醇(95:5)为流动相时，对氨基酚出峰时间约4 min，峰型较好，与相邻色谱峰分离度符合要求。

 

3.2  检测波长的选择

 

《中国药典》2020年版二部对乙酰氨基酚滴剂、咀嚼片和颗粒剂对氨基酚检查项下的检测波长均为257 nm，也有文献采用254、262、245 nm进行检测[3-7]。为提高本实验的灵敏度，取对氨基酚对照品溶液，在200~400 nm波长范围内进行紫外光谱扫描，对氨基酚的最大吸收波长为230 nm。对氨基酚在254 nm、257 nm下吸收值均远低于在230 nm处的吸收值。因本实验仅针对对氨基酚进行检测，故以230 nm作为本方法的检测波长。在此波长下，方法的灵敏度高、专属性好，其他成分不影响对氨基酚的检测。

 

3.3  系统适用性的考察

 

《中国药典》2020年版二部对乙酰氨基酚及其制剂标准中，对氨基酚检查项下系统适用性要求均为理论板数按对乙酰氨基酚计算。在本实验中，对氨基酚与相邻杂质的分离度以及对氨基酚的理论板数对测定的准确性影响较大。取加标供试品溶液在三台仪器上使用三根色谱柱进行分析，对理论板数按对氨基酚计算均大于2 000，对氨基酚与相邻峰之间的分离度均大于1.5。综上，方法的系统适用性要求定为“理论板数以对氨基酚峰计算不低于2 000。对氨基酚与相邻色谱峰之间的分离度应符合要求。”

 

3.4  对氨基酚的限量

 

《中国药典》2020年版二部对乙酰氨基酚各制剂品种项下对氨基酚检查项的限度均为“不得过对乙酰氨基酚标示量的0.1%”，参考该限度，拟定标准中对氨基酚的限度设定为“不得过对乙酰氨基酚标示量的0.1%”。

 

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《中国药品标准杂志》第23卷第1期 2022.1

江坤， 陈颜清， 蔡锦雄， 庞发根， 李玉兰， 王铁杰

 

(深圳市药品检验研究院， 广东 深圳 518057)