空白对照平板上又生长菌落，到底怎么溯源？

 

一、方法原理：

 

采用头脑风暴法（拍脑袋想，纸上谈兵）和逻辑学方法进行简单推理判断。一边找污染源，一边在找的过程中消除掉一些污染源。在顺序排除污染源时，可以为下一步做铺垫，消除掉一些绊脚的可能性，从而排除起来更顺畅。查找其他步骤建立良好基础也是为了最终目的服务，最终目的就是消除所有潜在污染源。这里很佛系的讲，找到或没找到污染源头都可以，不必太纠结。

 

二、建立假设（越详细越好），还原“案发现场”。

 

假设按照GB 4789.2-2016进行菌落总数计数，操作过程如下：

 

（一）称样、均质，制备浓度0.1g/mL的样品匀液B。

 

超净台通风，开着照明灯。点燃酒精灯，在火焰周围称样：称取样品A25.0g，入到1L的均质袋里，同时把灭菌好的225mL磷酸盐缓冲溶液，也加入到1L的均质袋里，总体积250mL，封口，计为样品匀液B。

 

均质袋拿出超净台，放入桌面上的均质器内，开启均质器拍打均质袋1min。取出均质袋，放入超净台内，放在均质袋支架上。

 

（二）10倍梯度稀释法稀释样品和制备空白对照。

 

超净台通着风，酒精灯燃着，在火焰周围开启均质袋口，用1mL移液器装上吸头盒里面的1mL规格的移液器吸头，开始10倍梯度稀释。

 

吸取1mL样品匀液B（0.1g/mL），加入预先灭菌过的18mm×150mm试管中（装有灭过菌的9mL磷酸盐缓冲溶液），得到样品匀液C（0.01g/mL）。

 

同理：吸取1mL样品匀液C，加入预先灭菌过的18mm×150mm试管中（装有灭过菌的9mL磷酸盐缓冲溶液），得到样品匀液D（0.001g/mL）。

 

...此为10倍梯度稀释法原理，如果要稀释n个10倍管（n≥3），按照同理往下即可。暂时认为样品匀液B、C、D浓度就够用了。

 

（三）倾注平板法制样品皿和空白对照皿。

 

预先准备8个灭过菌的空培养皿、1瓶200mL左右的熔化的PCA培养基保温在水浴46℃中。混匀样品匀液B、C、D。

 

分别取1mL样品匀液B，加入到空白皿1、2，

 

分别取1mL样品匀液C，加入到空白皿3、4，

 

分别取1mL样品匀液D，加入到空白皿5、6，

 

分别取1mL磷酸盐缓冲溶液，加入到空白皿7、8。

 

倾注PCA培养基至1~8皿，每皿20mL，冷却、凝固。这样，装有样品的皿分别是皿1、2、3、4、5、6，里面的浓度分别为0.1g/mL,0.01g/mL,0.001g/mL；皿7、8为空白对照皿。

 

（四）培养、计数。

 

将皿1~8，倒置放入培养箱中，36℃培养48h。菌落计数。

 

（五）发现空白对照皿中有菌落污染。

 

假设发现：1.很多菌，比如几十个以上。

 

假设发现：2.皿7菌落数0，皿8菌落数1。意思菌很少。

 

三、空白污染来源可能性的理论分析：

 

（一）要进行溯源性调查，要了解几个概念和相互关系。

 

1.概念：充分条件，必要条件，充要条件。

 

2.相互关系：

 

假设A是条件，B是结论，设C、D分别为A、B所描述对象的集合，则有下列定义和推论：

 

（1）由A可以推出B，由B可以推出A，则A是B的充分必要条件（此时C等于D）；

 

（2）由A可以推出B，由B不可以推出A，则A是B的充分不必要条件（此时C包含于D，且不相等）；

 

（3）由A不可以推出B，由B可以推出A，则A是B的必要不充分条件（此时D包含于C，且不相等）；

 

（4）由A不可以推出B，由B不可以推出A，则A是B的既不充分也不必要条件（此时C不包含D，D也不包含C）。

 

（二）如果（一）中充分条件，必要条件，充要条件相互关系太抽象，想不明白的话，可以参考具体事例进行理解。

 

例如：空白对照皿中污染（以后简称：空白污染）和污染来源之间的关系。

 

判断1：假如灭菌锅灭菌不彻底，那么空白肯定污染（理论上）。

 

判断2：假如移液器引入杂菌，那么空白肯定污染（理论上）。

 

理解1：观察判断1和判断2，我们发现，只要[灭菌锅和（/或）移液器]引入污染，都会导致最终空白污染，所以（1）灭菌锅灭菌不彻底是空白污染的充分条件之一。

 

理解2：空白污染，不能推出灭菌锅灭菌不彻底。

 

因为假设灭菌锅灭菌彻底，其他环节污染，也能导致最终空白长菌。所以（1）灭菌锅灭菌不彻底是空白污染的非必要条件。

 

理解3：综合理解1和理解2，（1）灭菌锅灭菌不彻底是空白污染的充分非必要条件。

 

（三）弄清楚空白污染（结果）和各个环境引入杂菌（污染的可能性，条件）之间的关系，我们就可以进行推断，也就是溯源性调查。

 

还有一些隐藏的条件如：空白对照皿中污染的菌不是凭空产生的（因为微生物不会凭空出现），它只会从我们做实验的操作过程的某一个或多个甚至极端到全部环节引入。又因为空白污染的来源很多，某一个污染都只是空白污染的充分非必要条件（一个源引入污染或多个源引入污染，都会导致最终现象-空白污染）。

 

我们只要把所有的污染来源都查到抓到一起，把所有的污染来源看成一个整体，那么这个整体和空白污染就构成了充分必要条件。这其中存在没有引入污染的，也藏着1个或多个污染来源。我们的目的就是抓到（如果可能）并消除污染来源，使以后不再发生。

 

（四）在（三）中提到“我们的目的就是抓到（如果可能）并消除污染来源，使以后不再发生。”这里对如果可能进行解释。

 

我们溯源调查采用的是通过假设、重复实验验证这样的一个方法，这是有别于真实发生了污染的那次实验，时间和条件都有变化，是一种情景还原模拟。

 

重复试验有时候能重复出来，比如设备某一个地方污染，再去检测还能检测到菌。

 

重复试验有时候不能重复出来，比如检测员污染那次手上带了菌，情景再现时，消毒和操作都严格了，重复不出来了。所以针对这一现象我们要提醒做重复实验的人员，让他尽量还原上一次的情况，不必太认真也不必太放松，越接近上一次的情况模拟效果越好。

 

重复试验的可能出现和可能不出现的不确定性，让我们要我们适当进行变通，由原来找到污染来源并消除，改成努力寻找污染来源，如果抓不到，退而求其次，只要能消除污染来源，通过后续验证，发现这一现象不在出现，也可以认为达到了溯源调查的目的。

 

这个地方一定要想通，否则可能造成一种高尚的自虐行为。这一点要特别提醒检测员，是因为我们特殊的职业习惯（趋近完面和强迫症），检测人员越严谨认真，有时候容易钻牛角尖，找不到污染来源时，可能被严谨和认真“反噬”，走火入魔，吃不好睡不好，整个人都不好了。

 

四、头脑风暴法列出可能的污染来源：

 

回看 “二、假设条件（越详细越好）”写各种设备及操作过程较为详细，这一点在溯源性调查中非常重要。我们要建立机制寻找较为全面的污染来源。

 

作为微生物单一菌体肉眼不可见的特点，污染的来源藏在每一个细节里，所以进行头脑风暴时，一定要观察入微，调查仔细，不放过任何的可能性，简单的思想就是：怀疑一切。

 

如果想象力不很强大的人，平时可以多练习冥想，提高自己想象力。也可以通过回忆检测过程、纸上谈兵模拟推演检测过程来帮助我们还原一个近似真实的“案发现场”。

 

简单风暴如下（因为每个人的操作习惯及每一次偶然事件形成的特殊性，每个人要根据自己的情况进行仔细进行）：我们按检测过程进行规律性的瞎猜。

 

1. 灭菌锅：

 

1.1 灭菌不彻底，灭完还有菌活的；

 

1.2 其他一切诡异的只有想不到没有做不到的奇迹一般的污染可能性的客观存在。

 

2. 超净台：

 

2.1 超净台过滤效力下降，风中带菌。

 

2.2 其他一切诡异的只有想不到没有做不到的奇迹一般的污染可能性的客观存在。

 

3. 超净台内部操作不当：

 

3.1 没开风。

 

3.2 风力太小，乱流。

 

3.3 超净台没擦拭，环境恶劣。

 

3.4 操作过程中离酒精灯远。

 

3.5 操作过程移液器带菌污染。

 

3.6 操作过程中拿进拿出样品污染影响了环境造成污染。

 

3.7 人带进去菌污染。

 

3.8 其他一切诡异的只有想不到没有做不到的奇迹一般的污染可能性的客观存在。

 

4. 培养箱内造成的污染。

 

4.1 风太大，吹进去。

 

4.2 皿太湿，菌爬进去。

 

4.3 培养箱环境恶劣，只要进去就有菌污染的小概率奇迹事件存在。

 

4.4 其他一切诡异的只有想不到没有做不到的奇迹一般的污染可能性的客观存在。

 

5. 其他：

 

5.1 枪头不新鲜。

 

5.2 枪头盒不新鲜。

 

5.3 皿灭完湿漉漉的没吹干，菌爬进去了。

 

5.4 其他一切诡异的只有想不到没有做不到的奇迹一般的污染可能性的客观存在

 

五、污染源调查要充分考虑顺序性：

 

做事有序，处理事情就显得简单，大脑处理起来也愉悦，同样溯源性调查时，充分利用分类学，真相会相对容易发现。

 

所以枚举时，要充分考虑顺序性。尽可能分块进行头脑风暴，一方面不容易漏掉，一方面也有利于我们回头检查自己是否漏掉了一些细节性的部分，化整为零，逐一击破。相反，杂乱无章的乱想是不科学的，扰乱了自己的心绪，也容易漏掉一些可能性。

 

另外，顺序条理的想问题，就把随机性变成了一种特殊性，更好找规律。这在消除时也有帮助。

 

六、提出消除污染来源的试验方案：

 

经过充分、有序的找到污染来源后。我们可以按从流程的源头往后重新重复试验和排查。采用排除法。

 

我们做微生物实验最重要的概念之一“无菌概念”。也许无菌概念太抽象，那么我们反过来，提出“有菌概念”。意思整个环境都是有菌的，这就是有菌概念。那么要想获取无菌的环境，只有在有菌的环境中撕开一个口子，制造无菌环境。

 

（一）首先，起点定在灭菌锅这里（如果煮沸的培养基就不是这里了，没说尽的事情自己灵活掌握），灭菌锅是“洁净之源”，重复灭菌看灭菌锅灭菌充分不充分，由于灭菌后验证单独不好执行。就考虑和培养箱、培养基联系在一起进行捆绑验证。意思就是没有污染就都算合格，有污染再分别调查看是哪个污染。

 

同时重复实验时考虑培养皿、培养基、移液器吸头等是否有引入污染的可能性，都通过重复实验和简单对比进行。

 

具体操作：准备100mL的三角瓶，每瓶配30mL的固体培养基，如此配10瓶，放在灭菌锅的不同位置和层之间，按照之前的灭菌方式灭菌（不要过严也不要放松，目的是尽可能的还原污染时候灭菌的情况）进行灭菌，灭菌后凝固了直接放培养箱里面36℃培养48h。

 

（二）灭菌锅灭菌不彻底和培养箱的污染可能性的排查。

 

培养后观察结果，再没有看到皿时，会有2种可能：没长菌和长菌。

 

1.没长菌。

 

认为培养箱、灭菌锅是没有污染的，继续下一步调查。如果对一次试验不放心，可以重复此实验3~5次，都没有问题则认为这步骤无污染。

 

2长菌。

 

认为灭菌锅、培养箱之间至少一个环节造成污染，为了区别是灭菌不充分还是培养过程进去的，灭完菌后让三角瓶适当干燥后，直接室温放置（培养）48h，从而可以区分。另外需要注意的是，如果瓶子培养基菌很多，表面、内部都有，那么可以认为是灭菌不彻底，因为一方面环境空气中要进入三角瓶不容易（有封口膜封口），就算进入数量也少，要进入培养基内部可能性几乎不可能，所以这时候重点就放在验证灭菌锅灭菌效果上，比如使用生物指示剂验证。

 

（三）灭菌锅已确认污染来源情况并进行了消除后，开展超净台内污染可能性的排查。

 

针对“2.1 超净台过滤效力下降，风中带菌”，做沉降菌试验，看看吹出来的风是不是有污染。这时候顺序排查的优势就出来了，只有锅好的，培养基灭完是无菌的，沉降菌出现菌才能说明排风有问题，当然同时要注意排除人的污染性。

 

做沉降之前，超净台可以进行一次擦拭和清洁，这样如果没有污染了也好，因为我们找到或找不到污染源都不要紧，重要的是以后不再出现这个污染的现象。

 

针对“超净台内部操作不当”的原因，要考虑人为原因，要建立无菌概念，以及可以几个人一起操作或进行外部培训等，消除个人操作的一些陋习。从而达到反复实验也不污染，才能上岗，总之微生物基础还需要加强。

 

超净台没问题了，就去考虑培养箱的问题。

 

七、总结一下污染物溯源调查的思路：

 

污染物溯源调查没有定法，脑子要活络，一方面要非常熟悉检测流程和建立关键控制点，同时要充分考虑被污染的每一个环节，前后推敲，找出尽可能多的污染来源。在设想污染可能性的起始阶段，要放下“我没有做错，我没污染”的思想包袱，要怀疑一切，假设每个细节都有污染，我们通过试验去证明是否有污染，因为实践是检验真理的唯一标准，真理没有经过实践验证，都可能是谬误。这是建立在我们唯物主义价值观以及认为世界是客观存在、以及客观存在是正确的统一认识基础上的（这个认识从牛顿时代才建立的）。

 

理出一个排除的思路，尽量按照顺序、分块、化整为零的方式进行，充分考虑各种可能性之间的如关联、排他等内在逻辑关系。排除过程中严谨推断，不能遗漏。

 

同时还要考虑主观能动性，有些地方单一搞不了，那就分分合合，怎么方便怎么能达到最终消除污染就行。

 

这样一步一步走下去，最终找到真相，从而消除空白污染。