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含量测定对照品主峰与供试品无法重叠问题探讨

嘉峪检测网        2021-04-06 15:00

1.问题描述

 

1.1 含量测定中,对照品主峰与样品主峰RT值无法完全重合;

 

1.2 检测限1.3%,灵敏度达不到要求(要求定量限≤0.2%)

 

2.原分析方法参数与图谱

 

2.1 原方法参数

 

 

含量测定对照品主峰与供试品无法重叠问题探讨

 

2.2 典型图谱

 

 

含量测定对照品主峰与供试品无法重叠问题探讨

 

3.原因分析

 

3.1 波长过低,在线混合,导致基线噪音大,含量1.30%才能达到LOD水平;

 

3.2 进样量4μL,HPLC中,一般杂质外标的含量不低于5μL;

 

3.3 样品溶液呈酸性(原配样方式直接用乙腈稀释),磷酸缓冲盐pH4.5左右,无缓冲能力;

 

3.4 在线混合,HILIC色谱柱平衡时间很长,若无梯度要求,应预混好流动相。

 

 

4.方法优化

 

4.1 优化样品前处理方式

 

样品配制方法:样品溶液称取规定量于容量瓶中,先用三乙胺调节pH至6-7,再用乙腈稀释至容量瓶刻度线。

 

原方法参数进此溶液得到和上述一样的图谱,对照品主峰还是不能与样品主峰完全重合。

 

4.2 优化方法参数

 

含量测定对照品主峰与供试品无法重叠问题探讨

 

 

4.3 优化图谱

 

含量测定对照品主峰与供试品无法重叠问题探讨

 

 

4.4实验结果

 

(1)提高波长至205nm;预混流动相;提高进样量至5μL;这三种方式,提高了方法的灵敏度。经预验证后,LOQ限度为0.083%,大大提高了方法的灵敏度。

 

(2)使用5mM磷酸二氢钾+5mM磷酸氢二钾的缓冲液,提高了方法的缓冲能力,样品溶液和标准溶液RT值能完全重现。

 

5.总结

 

5.1 灵敏度计算公式S/N=2H/noise,所以灵敏度不完全取决于峰高,要综合比对峰高和噪音,选取合适的波长;

 

5.2 样品过酸或者过碱,可能会导致RT重现性较差,可通过提升缓冲液的缓冲能力去解决(缓冲液pH与样品溶液的pka需相差1.5以上)。

 

以下是部分缓冲液的缓冲范围

 

含量测定对照品主峰与供试品无法重叠问题探讨

 

5.3 若是无梯度变化,可预混流动相,规避在线混合产生气泡导致RT漂移的情况发生;

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