介孔二氧化硅薄膜已逐渐被用于生物涂层设计。本研究采用油水两相法，在钛纳米管表面均匀生长出垂直向介孔二氧化硅薄膜（VMSTF）。所构成的大孔-介孔梯度形貌，使钛表面的物理结构和化学成分与骨组织更加接近。研究发现该涂层兼具降解快、可载药、促成骨的功效。这是VMSTF作为骨种植体涂层的首次探索，为相关研究提供了借鉴。

01、研究内容简介

牙种植修复技术已广泛地应用于恢复患者牙列缺损或缺失，成为一种常规的修复方法，但更快更好的骨结合仍是目前临床种植技术需解决的关键问题。种植体表面处理是影响骨结合的一个重要因素，也是目前国内外研究热点。课题组前期在钛表面采用酸蚀和阳极氧化技术制备的微米/纳米管结构，因其类似骨组织结构的仿生设计而表现出优异的促成骨功能。然而，进一步在纳米结构基础上进行介孔结构修饰或将实现更理想的骨仿生效果，值得探索。介孔硅纳米薄膜因其极高的比表面积、易于修饰的内外表面，无毒可降解等特点受到了越来越多的关注。然而在钛种植体表面制备垂直向介孔硅纳米薄膜尚未见文献报道。传统的蒸发诱导自组装法制备的薄膜始终存在两大局限：（1）由于硅胶束有水平排列的自发趋势，该薄膜内部孔道多为水平走行（Parallel aligned mesoporous silica thin film, PMSTF），导致薄膜与外界的渗透性差。（2）目前钛基底表面往往会预先进行微纳米形貌加工，但这类薄膜厚度较厚，通常会覆盖整个基底表面，可能会阻碍这些活性形貌作用的发挥(Fig. 1a)。基于此，本研究创新性地在钛纳米多孔结构表面，采用油水两相法成功制备出垂直向介孔二氧化硅薄膜（Vertical aligned mesoporous silica thin film, VMSTF）（Fig. 1b）。该薄膜不仅具有直通外界的介孔孔洞（~3 nm），而且可沿纳米管（TNT）表面均匀、连续沉积，构成了复合梯度纳米结构。在此基础上本研究系统观察和讨论了VMSTF@TNT的降解行为、载药能力和成骨活性（Fig. 1c）。

Fig. 1 The structure comparison between conventional PMSTF (a) and VMSTF (b). The main steps for the preparation of VMSTF@TNT(c).

研究首先采用阳极氧化法，在纯钛表面构筑了大孔级TNT阵列结构（管径约100 nm）。TNT是已被广泛研究的，具有内在骨诱导活性的经典形貌结构。在此结构基础上采用油水两相法，在纳米管表面制备垂直向介孔硅薄膜（VMSTF）。通过透射电镜观察，可见VMSTF与TNT紧密交联，并沿管壁四周均匀沉积，厚度约20 nm。VMSTF沉积过程较为缓和且可控。在2 h时TNT表面首次出现介孔结构，此后VMSTF主要在管内沉积，直至24 h后彻底填满管腔而转变为管外沉积（Fig. 2）。

Fig. 2 FE-TEM (a, b), STEM (inset) and growing process observations (c) of  VMSTF on TNT.

研究者接着在模拟生理环境下（PBS，37℃），观察到了VMSTF的高速降解性。结果显示：介孔形貌2 h后基本消失，24 h后薄膜基本降解完全，最终硅离子释放总量约为10 ppm（Fig. 3）。VMSTF所表现的小时尺度内的降解速率以及稀少的硅释放总量，为其生物安全性奠定了基础。

Fig 3. ICP-AES analysis of the released silicon ion (a) and the FE-SEM observations of VMSTF@TNT after incubation with PBS for 72 h (b). White scale bar=200 nm, yellow scale bar=50 nm.

为了验证VMSTF的载药能力，本研究采用地塞米松（DEX）作为模型分子进行了药物加载/释放效率实验。FE-SEM及ATR-FTIR光谱结果证实了TNT，PMSTF，VMSTF@TNT表面均成功负载DEX。但VMSTF的负载量是其余两组的2.3倍。此外，VMSTF表面药物虽释放稍缓，但释放率未见明显差异。因此，VMSTF较单纯的纳米管或传统的水平介孔硅具有更出色的载药性能，但若要实现更理想的缓释或控释效果可能需要进一步修饰（Fig. 4）。

Fig 4. Drug delivery from different surfaces. (a) DEX loading observation by FE-SEM. White scale bar=200 nm, yellow scale bar=50 nm. (b) ATR-FTIR spectrum of DEX loaded samples and (c, d) their DEX loading/release behaviors. *p< 0.05, **p< 0.01 (vs VMSTF@TNT).

植入物表面的亲水性与成骨细胞的早期生物学行为密切相关。VMSTF@TNT表面展现出较强的亲水性（Fig. 5a），这可能由于介孔孔洞表面所带的大量硅羟基引起。为了进一步验证VMSTF@TNT的体外生物学效果。本研究采用MC3T3-E1细胞进行了一系列体外评价。结果表明：VMSTF@TNT表面细胞早期粘附数量、细胞活力，成骨分化能力均显著增强（Fig. 5b-j）。这些结果证实，VMSTF可以在成骨细胞功能的多个阶段发挥积极作用。

Fig 5. Hydrophilicity, cell behaviors and osteogenic differentiation on the surface of three samples. (a) Water contact angle measurements. (b, c) CLSM images showing the attachment and morphology of MC3T3-E1. White scale bar=200 nm, yellow scale bar=50 nm, blue bar=5 μm. (d) Quantification of attached cell counts. (e) Cell viability of MC3T3-E1 as measured by CCK-8. (f) Relative mRNA expression of four osteogenic genes. (g, h) The ALP activity staining and quantification. (i, j) The calcium nodules formation evaluation by Alizarin Red staining and semi-quantification. *p< 0.05, **p< 0.01, ***p< 0.001.

总结：通过油水两相法制备的垂直向介孔硅薄膜，使钛表面在大孔级纳米管结构基础上进一步形成了介孔级结构和硅元素的负载，这与骨组织结构和成分更加接近。该结构中，介孔通道与外环境之间的有效沟通可带来三个主要的突出优势：1. 降解速度快，可以使效应细胞及时与钛基底接触，充分发挥基底纳米管结构的促成骨优势；2. 具备药物装载/释放能力，可用于治疗；3. 通过介孔结构与硅元素的释放可促进成骨细胞粘附和分化，进一步增强纳米管的成骨能力。这项工作为生物材料表面涂层设计提供了新的研发策略，显示了介孔材料在组织工程中的广阔应用前景。

该研究得到了国家自然科学基金（81530051/   31800790/ 31670966）、陕西省重点研发计划项目(2019SF-031)、丹麦Frie   Forskningsfond 基金(9040-00219B)等项目支持。

原文信息

Zhe Li, Yide He, Lasse Hyldgaard Klausen, Ning Yan, Jing Liu, Fanghao Chen,Wen Song*, Mingdong Dong*, Yumei Zhang*.   

Growing vertical aligned mesoporous silica thin film on nanoporous substrate for enhanced degradation, drug delivery and bioactivity. 

Bioactive Materials 6 (2021) 1452–1463.