眼睛是仅次于大脑的第二复杂的身体器官。眼睛局部给药是最常见且方便的药物治疗方式。由于眼睛结构的复杂性，药物进入眼睛后的吸收和分布等过程非常复杂，使得药代动力学性质的评估显得非常困难。在临床前研究中，小分子药物常采用与人有相似的眼解剖结构的兔子，来开展临床前药代动力学研究。局部给药实验动物后，收集眼部水相体液和各种眼部组织，完成样品的前处理与分析检测。对于临床研究，能收集到的样品种类是非常有限的，因此定量检测泪液中药物的浓度，是研究眼科类药物有效的工具之一[1]。
本文将从人泪液的组成和性质，泪液样品的采集和生物分析方法建立等方面进行介绍，带领各位读者了解临床研究中，泪液药物浓度测定的难点和解决方法。
人泪液的组成和性质
眼泪是泪腺分泌的一种透明无色体液，正常状态pH约为6.5~7.6。泪液在结膜囊均匀地分布，形成一层液体的薄膜，在医学上叫泪膜(tear film)。泪膜通常被描述为三层结构（图1），由一个内部的黏液层组成， 中间的水层和表面的脂质层。泪膜总厚度通常为7-10 μm，表面脂质层约为1 μm，水层厚度约为6-10 μm[2]。
图1泪膜的结构[2]
泪液组成中绝大部分是水，并含有少量无机盐、蛋白质、溶菌酶、免疫球蛋白A、补体系统等其他物质。对泪液的组分，大量的文献进行了详细的报道，如下表格1中介绍了每100 mL泪液中各个组分的浓度。泪液中蛋白占比约为0.6~0.8%，其中白蛋白约占0.4%。泪液可以分为，基础泪液，刺激泪液和情感泪液，不同类型泪液基质中组分存在差别。不同年龄，性别，健康状态的人，泪液的成分也会有差异。眼泪的成分还与是否佩戴隐形眼镜有关[2]。
为了缓解干眼症患者泪液质量异常的现象，人工泪液作为理想的泪液替代品应运而生。人工泪液能促进形成功能性泪膜，起到滋润眼睛的作用。人工泪液常含有0.1%透明质酸钠和羟丙基甲基纤维素，来模拟眼部粘蛋白，来增加泪膜的厚度和稳定性[2]。
了解人泪液的组成和理化性质，对泪液样品的收集，泪液基质样品生物分析方法开发有重要的作用。
表格1文献报道的泪液中主要成分的浓度(mg/100mL)[2]
常用的泪液样品采集方法:文献报道的泪液样品采集方法，包括泪液分泌试纸（Schirmer strips）法，毛细管（glass microcapillary tubes）法，手术海绵（Surgical sponges）法，玻璃棒（glass rods）法，刮片（spatulas）法和酚红棉线（phenol red thread tear test）法等。其中泪液分泌试纸（Schirmer strips）法和毛细管（glass microcapillary tubes）法，常常用于临床试验泪液样品的采集[3]。
泪液分泌试纸（Schirmer strips）法
1903年德国眼科医生Otto Schirmer，开创了用吸水纸测量眼睛泪液分泌的方法，被广泛用于干眼症的诊断。由于该方法经济实惠，可操作性强，也被用于临床试验中，进行眼部生物标记物的分析，以及临床试验药物在泪液中浓度的定量分析。Nery García-Porta等报道5种商品化的Schirmer试纸，并从外观，长度，厚度，重量，是否有刻度和荧光素等物理性质，以及吸收和释放出泪液的体积等方面进行了详细比较，可以作为Schirmer试纸选择的依据[4]。
采样时，将检测试纸一端折弯，并置于下睑内侧三分之一结膜囊内，其余部分于眼睑皮肤表面，一段时间后收集被泪液浸湿的试纸，置于容器中，采集示意图参见图2。
图表2泪液分泌试纸法采样示意图[5]
毛细管（glass microcapillary tubes）法
将玻璃毛细管的尖端置于泪河下缘，通过虹吸作用，从结膜囊中采集泪液，采集示意图参见图3。临床操作中，受试者尤其是敏感性受试者，容易对毛细管采集泪液产生恐惧。该方法要求采集人员具有更多的经验，特别是对于泪液量较少的干眼症患者，操作具有挑战性[5]。
图表3毛细管法采样示意图[5]
在临床试验中，为了减少不同时间点或不同受试者泪液收集体积的差异，需要制定一套标准的操作流程，来指导临床泪液样品的采集。如试纸和毛细管放置位置，眼睛注视方向，室内空气湿度，温度和流动性等细节对泪液收集体积都存在影响，统一的操作标准能减少采样体积的偏差[6]。准确地测量泪液样品体积是临床泪液药代动力学研究中，需要解决的重要问题。由于收集装置上没有准确定量的刻度，泪液试纸或者毛细管减重法成为泪液样品体积测量首选方法。
泪液样品LC-MS/MS生物分析方法建立
以试纸采集的泪液样品为例，来介绍方法建立中的难点和解决思路。泪液基质难以获得，选择合适的替代基质是生物分析方法建立的关键。泪液收集试纸成分复杂，引入了标尺刻度和荧光素等干扰，对于生物分析方法样品前处理和仪器的灵敏度带来了挑战。图表4为临床泪液样品采集和生物分析方法的常规流程。
替代基质的选择
由于空白泪液基质稀少，比较难获取，选择合适的替代基质，是方法开发需要解决的首个问题。人工泪液因具有泪液相似的成分，可以作为方法开发的起点来进行优化。
样品前处理
与常规血浆样品前处理不同，泪液试纸样品前处理，需要将目标化合物从泪液试纸上释放出来。结合化合物的理化性质，泪液的组分和性质，以及试纸上刻度和荧光素的成分和性质，选择合适的提取溶液，将化合物从试纸上浸泡出来。对于泪液试纸浸泡液，蛋白沉淀，液液萃取和固相萃取，可做为随后的样品前处理方式，来进行泪液基质样品的净化和浓缩。内标在LC-MS/MS生物分析方法中作用不言而喻，稳定性同位素内标是最优的选择，内标引入的时机，对于泪液基质生物分析方法的建立至关重要。
方法的灵敏度
泪液样品体积少，除了净化和浓缩样品外，还需要通过液相和质谱方法上来提高灵敏度。选用灵敏度更高的质谱仪器系统，是最为直接的办法；使用适合分析物离子化的流动相和添加剂，优化液相梯度，能增加化合物的离子化效率，提高方法的灵敏度。提高进样量也能提高灵敏度，前提在于样品前处理和液相方法能很好的去除基质效应，使得进样量提升带来的响应增加大于基质效应的影响。
图表4泪液样品采集和生物分析方法的常规流程
泪液基质生物分析方法建立中，替代基质选择，泪液试纸浸泡液选取，样品前处理方法的优化，液相质谱参数的调整等多个环节具有相关性，需要整体规划，再具体优化调节，才能建立稳定且适用的生物分析方法来支持临床样品检测。
参考文献
[1] Hardik Chandasana* Challenges Associated with the Quantification of Tear Fluids[J]. Chandasana, J Bioequiv Availab 2016, 8:6. DOI: 10.4172/jbb.10000e73.
[2] Bright AM, Tighe BJ (1993) The composition and interfacial properties of tears,
tear substitutes and tear models[J]. J Brit Contact Lens Ass 16: 57-66.
[3] Janusz Pieczyński, et al. Tear fluid collection methods: Review of current techniques. European Journal of Ophthalmology. DOI: 10.1177/1120672121998922
[4] Nery García-Porta, Aisling Mann, et al. The potential influence of Schirmer strip variables on dry eye disease characterisation, and on tear collection and analysis. Contact Lens and Anterior Eye. DOI: 10.1016/j.clae.2017.09.012
[5] Franziska Bachhuber, et al. Diagnostic biomarkers in tear fluid: from sampling to preanalytical processing. Natureportfolio. (2021) 11:10064. Doi: 10.1038/s41598-021-89514-8
[6] Etty Bitton, Walter Wittich, et al. Influence of eye position on the Schirmer tear test. Contact Lens & Anterior Eye. DOI: 10.1016/j.clae.2013.11.011
