前言

 

测量不确定度是在实验之中测量而得,不确定度是一个数值范围,并且是被赋予分散性质,被测量是落入了一个分散区间,在这个区间中含有正确的测得值。在日常实验中正确掌握测量不确定度是十分必要的。本文是基于色谱实验中测量不确定度的评价，供广大读者讨论。文中如有错误观点，欢迎指正。

 

测量不确定度从词义上理解，意味着对测量结果可信性、有效性的怀疑程度或不肯定程度，是定量说明测量结果的质量的一个参数。实际上由于测量不完善和人们的认识不足，所得的被测量值具有分散性，即每次测得的结果不是同一值，而是以一定的概率分散在某个区域内的许多个值。

 

虽然客观存在的系统误差是一个不变值，但由于我们不能完全认知或掌握，只能认为它是以某种概率分布存在于某个区域内，而这种概率分布本身也具有分散性。测量不确定度就是说明被测量之值分散性的参数，它不说明测量结果是否接近真值。

 

2002年版中国药典已经将《药品检测结果不确定度评定指导原则》收录，目前正在社会征求意见。未来是否强制执行也不得而知，不过在日常测量中考虑测量不确定度是一个大趋势，特别是作为色谱人一定要站得更高一些，看的更远一些！ 

 

1、色谱实验中测量不确定度来源

 

色谱实验中测量不确定度来源的识别应从分析测量过程入手，从影响测量结果的因素考虑，即对测量方法、测量系统和测量程序作详细研究，为此应尽可能画出测量系统原理或测量方法的方框图和测量流程图。测量结果不确定度的一般来源有：随机性不确定度和模糊性不确定度。

 

•随机性

 

随机性的不确定度可以用测量列结果（观测值）的统计分布来进行估算，并且以实验标准偏差表征，主要是条件不充分导致的。主要分为随机性导致的不确定度和系统导致的不确定度。下表是色谱实验中随机性不确定度的举例。

 

•模糊性

 

模糊性的不确定度可以用其它方法（根据经验或其它信息的假定概率分布）来进行估算，并且也以标准偏差表征。主要是物本身概念不明确导致的。下表是色谱实验中模糊性不确定度的举例。

 

2、色谱实验中测量数学模型建立

 

应规定被测量，如：含量、有关物质含量等，明确被测量与其所依赖的输入量的关系，还应包括对已知系统影响量的修正，建立数学模型。

 

Y = f (X1，X2，…，Xn)

 

Y为被测量（输出量）；

 

X为影响量（输入量）。

 

建立模型时，有一些潜在的不确定度来源不能明显地呈现在上述函数关系中，它们对测量结果本身有影响，但由于缺乏必要的信息，无法写出它们与被测量的函数关系。因此，在具体测量时无法定量地计算出它对测量结果影响的大小，在计算公式中只能将其忽略，而在模型中应包括这些来源。不过对于色谱实验中的数学模型大多数都可用计算公式代表。 

 

3、色谱实验中测量标准不确定度评估

 

标准不确定度是用一倍标准偏差表示的测量不确定度。标准不确定度u(xi)与测量结果xi的比值为相对标准不确定度，计算合成标准不确定度时，一般以相对标准不确定度代入计算公式，可以达到量纲的统一。包括A 类评定和B 类评定。

 

（1）A类评定

 

通过对规定测量条件下获得的测得量值的统计分析评定测量不确定度分量。采取逐项计算标准不确定度。

 

在重复性条件或重现性条件下对同一被测量X独立重复测量n次，得到n个测量值xi(i=1,2,3…n)组成一个测量列,被测量X的最佳估计值是n个独立测量值算数平均值，单个测量列的标准偏差为：

 

 

上式中n-1是自由度，标准偏差表征了被测量X的分散性。测量列的标准偏差随着测量次数的增加而趋于一个稳定的数值。

 

单个测量列平均值标准偏差就是测量X的A类标准不确定度。即：

 

 

测量列的平均值标准偏差则将随着测量次数的增加而减少。 

 

如果存在m个这样的测量列，单个测量列的合并样品标准偏差Sp为：

 

 

上式中Si是单个测量列的标准偏差，如果Si的自由度是υ0，则单个测量列的合并样品标准偏差为mυ0。

 

（2）A类评定流程

 

 

（3）B类评定

 

B类评定系指被测量X的估计值xi不像A类那样是由重复测得，其标准不确定度可用xi的可能变化的相关信息或资料来进行的一类评估。比如：权威机构发布的量值、有证标准物质的量值、校准证书、仪器的漂移、经检定的仪器的准确度等级、根据人员经验推断的极限值等。

 

B类评定的方法是根据有关的信息或经验，判断被测量的可能值区间[-a,+a]，假设被测量值的概率分布，根据概率分布和要求的包含概率p估计因子k，则B类标准不确定度uB可由公式得到：

 

uB=a/k

 

式中：a为被测量可能值区间的半宽度。当k为扩展不确定度的倍乘因子时（扩展不确定度是标准差的倍数）称包含因子（如果xi来源于说明书、校准证书、手册或其他资料），其他情况下根据概率论获得的k称置信因子。B类评定常用到正态分布、均匀分布和三角分布。对应k值见下表：

 

很容易看出，对于已经给出置信水平的，可以参照上表查出对应的k值，代入公式可以计算标准不确定度。对于未给出置信水平可采用假设矩形分布或三角分布进行计算。

 

（4）B类评定流程

 

4、合成标准不确定度

 

被测量Y的估计值y=f(x1,x2,…,xN)的标准不确定度是由相应输入量 x1,x2,…,xN的标准不确定度合理合成求得的，其表示式的符号为uc(y)。合成标准不确定度uc(y)表征合理赋予被测量之值Y的分散性，是一个估计标准偏差。如果各输入量是独立无关的，则合成标准不确定度为

 

事实上，在色谱实验室中为了简化测量不确定度，我们应尽量使得各输入量不相关。 

 

5、扩展不确定度

 

扩展不确定度是被测量可能值包含区间的半宽度。根据输出量的分布情况，求出所要求的置信概率水平p下的包含因子k ，则U=kuc(y)。

 

如果Y 接近于正态分布，则多数情况取p=95%，若不能判断Y的分布，则取k=2或者3。 

 

6、报告测量不确定度

 

报告测量不确定度应使用扩展不确定度U，同时给出特定的置信水平或包含因子。报告应尽可能详细，以便使用者可以正确地利用测量结果，通常不确定度的有效数字不要多于两位，末位后面如有数字需进位。

 

7、测量不确定度的评定流程

 

看了上述的理论知识，估计大部分读者已经思路混乱，不知所云。下面笔者将采用色谱实验室中分析的例子简单说明，希望可以帮助广大读者扩展思路。 

 

8、色谱实验室实例

 

HPLC法测定某原料药中主成分含量的不确定度评定

 

（1）测量方法

 

精密量取本品适量，加稀释剂成每1ml中含100μg的溶液，取10μl注入液相色谱仪，另取对照品适量，同法制备并测定，按外标法计以峰面积计算主成分含量。

 

（2）数学模型

式中X为某原料药的百分含量；WR为对照品称样量；PR为对照品溶液中主成分的峰面积；PS为样品中主成分的峰面积；WS为样品称样量；VS为样品稀释倍数；VR为对照品稀释倍数；p为对照品的纯度（标识量，无需考虑不确定度）；

 

（3）不确定度来源

 

采用鱼骨法进行罗列不确定度来源

 

（4）不确定度量化 

 

对照品的峰面积的测量不确定度主要来源于：

 

一是进样重复性，由前述知识可知，重复性属于A类不确定度。对照品溶液进行测定时，在进样、分离、检测过程中，产生的随机影响包括进样体积重复性、泵流速稳定性、分离重复性、检测器稳定、积分变动性等。

 

二是系统影响，比如泵、色谱柱、检测器等，由于对照品溶液与样品溶液在同等条件下进行，故该项标准不确定度互相抵消。则对照品峰面积的测量不确定度来源于进样重复性。

 

故u(PR)=对照品溶液中主成分6个峰面积的标准偏差（比如为4372）。同样，样品溶液峰面积重复性的测量不确定度u(PS)= 样品溶液中主成分6个峰面积的标准偏差(比如4303)。 

 

对照品稀释倍数的测量不确定度主要来源于：

 

一是容量瓶校准，属于B类不确定度。10ml的容量瓶的容量允差为±0.01ml，按矩形分布，标准偏差为：

 

 

二是容量瓶定容时的变动性，属于A类不确定度，将同一个10ml的容量瓶用水定容10次并称重，得出标准偏差为0.00040。

 

三是温度，液体膨胀系数，不过对照品溶液和样品溶液是在同一温度下制备，故膨胀系数引起的测量不确定度是可以忽略的。则对照品溶液稀释倍数VR的标准偏差：

 

 

同样，样品溶液的系数倍数VS的标准偏差为0.0058。

 

对照品称样量的测量不确定度主要来源于：

 

一是天平校准，属于B类测量不确定度。比如天平的最大允差为±0.03mg，按正态分布计算标准偏差为0.03/1.96=0.0153。此外还有天平灵敏度，不过由于对照品和样品的称样均在同一天平上，故天平称量范围内的系统漂移将被抵消，此项影响不计。

 

二是称量的重复性，属于A类不确定度。可根据天平说明书直接读取对应称样量重复性的标准偏差（比如0.02）。则对照品称样量WR的标准偏差：

 

 

同样，样品称样量WR的标准偏差为0.0252。

 

（5）计算合成测量不确定度

 

各来源测量不确定度总结如下：

 

 

某原料药中主成分百分含量

 

 

则合成不确定度为：

 

（6）计算扩展不确定度

 

测量结果符合正态分布，取置信概率为95%，选择包含因子k=2，U=2×93%=1.86%

 

（7）测量不确定度报告

 

HPLC法测定某原料药中主成分含量为X=（96.84±1.86）%，k=2。

 

结 语

 

色谱实验中测量不确定度的评定是一个及其繁琐和复杂的过程，在评定中应该最大程度上将测量不确定的来源考虑全面。测量不确定度评定能帮助我们找出测量结果超限的真正原因，规范测量过程中操作。

 

此外笔者认为，在药物研究中会逐渐强制要求对测量不确定度进行评定。因此，色谱实验中应该具有测量不确定度评定的意识。

 

另外测量不确定度与设备管理具有紧密联系，掌握好测量不确定度能够对设备进行最优选择，节约实验室采购成本。有兴趣者可与笔者单独联系。

 

以上是笔者对色谱实验中测量不确定度理论的简浅总结，难免不妥，还望批评指正!