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蛋白质

简介   

蛋白,蛋白质,朊,有机大分子

一、蛋白质 蛋白质是由 氨基酸 以“ 脱水缩合 ”的方式组成的多 肽链 经过盘曲折叠形成的具有一定空间结构的物质。 蛋白质(protein)是 生命 的物质基础,是有机大分子,是构成细胞的基本有机物,是生命活动的主要承担者。氨基酸是蛋白质的基本组成单位。机体中的每一个细...查看详情>>

蛋白质

简介   

蛋白,蛋白质,朊,有机大分子

一、蛋白质


蛋白质是由氨基酸以“脱水缩合”的方式组成的多肽链经过盘曲折叠形成的具有一定空间结构的物质。


蛋白质(protein)是生命的物质基础,是有机大分子,是构成细胞的基本有机物,是生命活动的主要承担者。氨基酸是蛋白质的基本组成单位。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。人体内蛋白质的种类很多,性质、功能各异,但都是由20多种氨基酸(Amino acid)按不同比例组合而成的,并在体内不断进行代谢与更新。


蛋白质是由C()、H(氢)、O()、N(氮)组成,一般蛋白质可能还会含有P()、S(硫)、Fe(铁)、Zn(锌)、Cu(铜)、B()、Mn()、I()、Mo()等。


这些元素在蛋白质中的组成百分比约为:碳50% 氢7% 氧23% 氮16% 硫0~3% 其他微量。


(1)一切蛋白质都含N元素,且各种蛋白质的含氮量很接近,平均为16%


(2)蛋白质系数:任何生物样品中每1g元N的存在,就表示大约有100/16=6.25g蛋白质的存在, 6.25常称为蛋白质常数


二、检测方法


食品中蛋白质的测定方法主要有凯氏定氮法,双缩尿法(Biuret法)、Folin-酚试剂法(Lowry法)、紫外吸收法和考马斯亮蓝法(Bradford法)


1.凯氏定氮法【GB/T 5009.5—1985】

实验原理
蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化,使蛋白质分解,分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量乘以换算系数,即为蛋白质含量。


2.双缩脲法(biuret法)


实验原理

双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。


此法的优点是较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定。


3.folin―酚试剂法(lowry法)


实验原理

这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的,只是加入了第二种试剂,即folin―酚试剂,以增加显色量,从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是:在碱性条件下,蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。folin―酚试剂中的磷钼酸盐―磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原,产生深兰色(钼兰和钨兰的混合物)。在一定的条件下,兰色深度与蛋白的量成正比。


此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20~250mg。


4.考马斯亮兰法(bradford法)


实验原理

双缩脲法(biuret法)和folin—酚试剂法(lowry法)的明显缺点和许多限制,促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。

1976年由bradford建立的考马斯亮兰法(bradford法),是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点,因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。

考马斯亮兰g-250染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收峰的位置(lmax),由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为,染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。

在595nm下测定的吸光度值a595,与蛋白质浓度成正比。


bradford法的突出优点是:

(1)灵敏度高,据估计比lowry法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比lowry法要大的多。

(2)测定快速、简便,只需加一种试剂。完成一个样品的测定,只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20分钟之间,颜色的稳定性最好。因而完全不用像lowry法那样费时和严格地控制时间。

(3)干扰物质少。如干扰lowry法的k+、Na+、mg2+离子、tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、edta等均不干扰此测定法。

此法的缺点是:

(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差。

(2)仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有:去污剂、triton x-100、十二烷基硫酸钠(sds)和0.1n的NaOH。(如同0.1n的酸干扰lowary法一样)。

(3)标准曲线也有轻微的非线性,因而不能用beer定律进行计算,而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。


6.紫外吸收法


实验原理

蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。


紫外吸收法简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。低浓度的盐,例如生化制备中常用的(NH42SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测,因为此时只需测定蛋白质浓度的变化,而不需知道其绝对值。


此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差,干扰物质多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质,有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质,会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表,再进行计算的方法,加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的,虽然经过校正,测定的结果还是存在一定的误差。


此外,进行紫外吸收法测定时,由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化,因此要注意溶液的pH值,测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。


三、国家标准


1 GB/T 24897-2010 粮油检验 稻谷粗蛋白质含量测定 近红外法

2 GB/T 24899-2010 粮油检验 小麦粗蛋白质含量测定 近红外法
3 GB/T 24901-2010 粮油检验 玉米粗蛋白质含量测定 近红外法
4 GB/T 24870-2010 粮油检验 大豆粗蛋白质、粗脂肪含量的测定 近红外法
5 GB/T 24871-2010 粮油检验 小麦粉粗蛋白质含量测定 近红外法
6 GB 24788-2009 医用手套表面残余粉末、水抽提蛋白质限量
7 GB/T 24318-2009 杜马斯燃烧法测定饲料原料中总氮含量及粗蛋白质的计算
8 GB/T 2910.4-2009 纺织品 定量化学分析 第4部分:某些蛋白质纤维与某些其他纤维的混合物(次氯酸盐法)
9 GB/T 14489.2-2008 粮油检验 植物油料粗蛋白质的测定
10 GB/T 5511-2008 谷物和豆类 氮含量测定和粗蛋白质含量计算 凯氏法
11 GB/T 21870-2008 天然胶乳医用手套水抽提蛋白质的测定 改进Lowry法
12 GB/T 17811-2008 动物性蛋白质饲料胃蛋白酶消化率的测定 过滤法
13 GB/T 19495.8-2004 转基因产品检测 蛋白质检测方法
14 GB/T 18868-2002 饲料中水分、粗蛋白质、粗纤维、粗脂肪、赖氨酸、蛋氨酸快速测定 近红外光谱法

收起百科↑ 最近更新:2017年11月09日

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