［摘要］聚山梨酯20/聚山梨酯80及泊洛沙姆188是抗体药物制剂处方中常用的稳定剂。随着研究及检测技术的不断进步，抗体药物在放置过程中，蛋白来源的可见异物/不溶性微粒可被检测到呈增加趋势，其起因可能与抗体药物制剂处方有关。本文对由制剂处方中聚山梨酯20/聚山梨酯80、泊洛沙姆引起的可见异物/不溶性微粒进行原因分析，明确现行指导原则及法规对可见异物/不溶性微粒的要求。在此基础上，结合药学审评实践，浅谈对抗体药物制剂处方中的可见异物/不溶性微粒审评的基本考量，以期提高企业对此类问题的关注，并为同类产品的研发提供参考。

抗体药物是生物制品行业发展最快的领域之一。既往抗体药物多以静脉滴注给药方式为主，近年来，随着抗体药物质量研究的深入以及患者依从性需求的提高，注射给药途径逐渐趋于主流［1 － 2］。与静脉滴注给药相比，注射给药需要抗体药物在单位体积内浓度更高，这使得抗体药物中辅料与抗体蛋白作用的概率增加，从而提高了可见异物/不溶性微粒增加的风险。

可见异物/不溶性微粒的控制是保证注射剂安全使用的一项重要指标，各国药典对其均有要求［3］，特别是近年来，随着全生命周期管理理念不断深入，以 及抗体药物研究成熟度不断加强，聚山梨酯20(polysorbate 20，PS20)、聚山梨酯80(polysorbate 80，PS80)、泊洛沙姆188(poloxamer 188，P188) 等抗体药物处方中常用辅料与抗体蛋白作用而导致可见异物/不溶性微粒数量发生变化的现象，以及随之可能增加的风险已被逐渐关注。《ICH Q9 Quality Ｒisk Management》明确了质量风险评估的理念及原则，即质量风险管理是一个系统的流程，在整个产品生命周期中进行质量风险评估应该基于科学知识并最终与对患者的保护相结合［4］。本文将结合审评实践及风险评估理念，就抗体药物中蛋白来源的可见异物/不溶性微粒增加问题提出相关思考，为此类药物的研发提供参考。

一、可见异物/不溶性微粒增加的原因分析

大多数蛋白都有形成聚体的倾向，抗体药物在生产、储存及运输时都会伴随缓慢的聚体形成过程，进而形成可见异物/不溶性微粒，甚至沉淀，现有技术已可以较好地解决并避免蛋白聚集的产生。本文将重点介绍由抗体药物制剂处方中常用辅料与抗体蛋白作用引起的蛋白源性可见异物/不溶性微粒。

PS20，PS80 与 P188 具有良好的蛋白质稳定性和安全特性，目前已成为生物制品中最常用的表面活性剂［5］。然而，在过去几年的研究中发现，由于此 2 种表面活性剂易发生化学降解，随着时间的推移，在含有该成分的制剂中可观察或检测到可见或不可见蛋白性质的颗粒［6-8］。

聚山梨酯是异质的混合物，容易通过多种途径降解，如化学水解、氧化和酶水解。不同途径之间的降解模式有显著的不同［9］，降解产物的种类可提示降解作用机制［10］。化学水解产生的主要降解产物为游离脂肪酸( free fatty acids，FFAs) ，但在生物制药相关条件下不太可能发生化学水解［11-12］; 氧化的降解产物包括过氧化物、醛、酮、脂肪酸酯和游离脂肪酸，其中游离脂肪酸为次要降解产物; 酶水解被认为是在抗体药物中聚山梨酯降解导致蛋白聚体微粒形成的根本原因。这些酶( 脂肪酶、酯酶等) 特别是宿主细胞蛋白残留中的一种磷脂酶 B2 可以在酯键处裂解聚山梨酯，从而形成 FFAs 和游离的基团或多元醇，由于 FFAs 在水溶液中溶解度差，当温度为5 ℃ 时，制剂中形成可见或不可见的颗粒，对其蛋白质的长期稳定性产生一定影响，从而影响药品的有效期。此外，除了 FFAs 和多元醇之外，PS20 的降解产物还可以包括由高级酯降解引起的单酯，因此酶降解也可以改变溶液中残留 PS20 的酯分布［13］。因此含聚山梨酯的单抗制剂中蛋白来源的微粒增加是否主要由溶解性较差的 FFAs 蓄积所致，还需研究者根据具体情况，深入分析及甄别。

P188 不像聚山梨酯易于降解，是可能替代聚山梨酯的表面活性剂，其可有效作用于空气-水界面， 在各种影响因素条件( 如热、搅拌、冻结) 下使抗体药物稳定［14］。但在 2 ℃ ～ 8 ℃ 长期稳定性研究中，含有 P188 组分的制剂中可观察到蛋白质与聚二甲基硅氧烷( polydimethylsiloxane，PDMS) 相互作用形成的颗粒，该颗粒往往比纯蛋白质颗粒要大，这种现象可能与蛋白质的物理化学性质及直接接触包材有关，蛋白质与 PDMS 之间的相互作用导致含 P188 的制剂中形成微粒。Grapentin 等［15］ 的研究显示，无 PDMS 的胶塞减少了这种粒子的形成。然而，当使用这个特殊的无 PDMS 塞子时，通过 FTIＲ 显微镜观察到氟聚合物粒子。蛋白质-PDMS  粒子的形成可能是由不同的因素决定，如 P188 竞争性地吸附到PDMS 界面的能力、系统中 PDMS 的数量和类型以及蛋白质的浓度和分子性质等，目前形成蛋白质PDMS 颗粒确切的相关机制尚未明确［16］。

二、现行指导原则及法规要求

可见异物系指存在于注射剂、眼用液体制剂和无菌原料药中，在规定条件下目视可以观测到的不溶性物质，其粒径或长度通常大于50 μm［17］，而肉眼不可见的非代谢性的颗粒杂质，粒径通常小于50 μm［3］，被划归至不溶性微粒范畴。生物制品中的不溶性微粒可能是气泡、硅油及蛋白质聚集产生的多聚体甚至是沉淀［18］。可见异物和不溶性微粒 2 项检查对不溶性物质的测量范围相互衔接，根据药品中不溶性物质的危害程度，分别从宏观和微观进行必要的控制，共同构成一个完善的对不溶性物质的质控体系［3］。

通常对不溶性微粒/可见异物的检查是按照《中华人民共和国药典》2020 年版三部通则 0903 “不溶性微粒检查法”及 0904“可见异物检查法”对不溶性微粒和可见异物进行，不溶性微粒检查通常是在可见异物符合规定之后进行［18］。

各国药典对可见异物及不溶性微粒均有相应要求，其标准基本与我国药典要求一致。

对于可见异物，我国药典中明确规定供试品中不得检出明显可见异物( 长度或最大粒径超过2 mm) ，生物制品注射用无菌制剂复溶体积 50 mL及以下，每支( 瓶) 中细微可见异物不能超过3个，复溶体积 50 mL 以上，每支( 瓶) 中细微可见异物不能超过5个［17］。欧洲药典〈2．9．20〉要求目视检查法对可见异物进行检定，颗粒数量在每瓶5个可见颗粒，可见颗粒的测试结果将会报告为“几乎无可见异物”［19］。

对于不溶性微粒，我国药典要求若采用第一法(光阻法)，则标示装量为 100 mL 以下的静脉用注射液、静脉注射用无菌粉末、注射用浓溶液及供注射用无菌原料药，除另有规定外，每个供试品容器(份)中含 10 μm 及 10 μm 以上的微粒数不得过6000 粒，含 25 μm 及 25 μm 以上的微粒数不得过600 粒。若采用第二法(显微计数法)，则标示装量为 100 mL 以下的静脉用注射液、静脉注射用无菌粉末、注射用浓溶液及供注射用无菌原料药，除另有规定外，每个供试品容器(份)中含 10 μm 及 10 μm 以上的微粒数不得过 3 000 粒，含 25 μm 及 25 μm 以上的微粒数不得过 300 粒。这一标准与欧洲药典［19］是相同的。不同的是，欧洲药典将该项目称为 亚可见颗粒(sub-visible particle)，并规定亚可见微粒的粒径为 10 ～ 25 μm; 我国药典将该项目称为不溶性微粒(particulate matter)［18］。欧洲药典对于不溶性微粒的检定方法及结果判定，与英国药典与美国药典基本一致。

此外，ICH Q4B《Test for Particulate Contamina- tion: Sub-Visible Particles General Chapter》［20］、ICH Q6B《Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological / Biological Products》［21］等国际指导原则均可作为可见异物、不溶性微粒研究分析及风险评估的依据。

目前国内外暂无专门针对由常用辅料与抗体蛋白作用引起的蛋白源性可见异物/不溶性微粒的相关指导原则或技术指南。

三、药学评价的基本考虑

由于抗体药物中抗原蛋白与表面活性剂作用的复杂性，随着抗体药物研究的深入，该类药物放置过程中可见异物/不溶性微粒有增加的趋势。药物研发者应对可见异物/ 不溶性微粒增加的原因进行充分分析，明确可见异物/不溶性微粒的组成，进而进行充分的安全性评估，并确定风险控制策略。以下笔者将结合审评实践，就上述几方面内容进行详细阐述。

3． 1  深入分析可见异物/不溶性微粒增加的原因

药物研发者应基于对可见异物/不溶性微粒增加的根本原因的理解，在药物开发早期发现并评估形成的风险，如发生概率及严重程度等。若在药物开发后期阶段及产品上市后阶段，发现可见异物/不溶性微粒增加，应分析其形成原因及组成，如是否为单纯的蛋白聚集或蛋白质-PDMS 颗粒或是溶解性差的FFAs 颗粒等。除采用药典方法对可见异物/ 不溶性微粒进行检定外，还可采用其他有效的蛋白、颗粒分析方法如傅立叶红外光谱法( FT-IＲ) 、流式细胞仪 ( Flow Cam 法) 、HPLC 法及蒸发光散射检测器法［5］等对可见异物/ 不溶性微粒结构或组成进行定性和定量分析，以明确其成分，所采用的非药典方法应经过完善的方法学研究和验证。同时，结合分析方法研究和验证结果，明确如何区别工艺特征的颗粒物与新增颗粒物。

3．2 进行充分的安全性评估

当药物放置过程中出现可见异物/不溶性微粒增加时，应及时回顾所有历史批次样品可见异物数据统计情况，包括长期、加 速和振荡条件下微粒变化情况，以判断整体变化趋 势。通过对可见异物/不溶性微粒形成原因的深入分析，明确其是否对药物本身质量产生影响。此外，应借鉴 ICH Q3D 指导原则［22］对元素杂质的风险评 估理念，对新增可见异物/ 不溶性微粒进行全面毒理学评估，确定其每日最大暴露量(PDE)，如有临床数据，应结合既往临床安全性数据评估新增可见异物/不溶性微粒的安全性。

3．3 风险防控手段

药物研发者应遵循 ICH Q9指导原则在早期进行风险识别［4］，将可见异物/不溶性微粒列为制剂关键质量属性(CQA)，建立可见异物/ 不溶性微粒风险管理方法，以评估及控制其风险。同时，在整个工艺和产品开发过程中，若识别到风险信号，如发现了微粒、聚山梨酯显著降解或微粒形成的高风险信号，药物研发者应展开原因调查并采取风险缓解或消除措施，以降低微粒形成的风险因素。

药物研发者在明确新增可见异物/不溶性微粒的形成与产品本身质量发生变化无关后，可针对其特性采取风险控制措施，如增加终端过滤、缩短有效期等。对于聚山梨酯引起的可见异物/不溶性微粒增加，亦可采用敲除宿主细胞脂肪酶基因、在纯化工艺中使用适当的色谱树脂以降低聚山梨酯的酶活性水平、采用聚山梨酯替代物或开发新的表面活性剂等; 对于P188 引起的可见异物/不溶性微粒增加，可根据分子特性对P188 进行改进，亦可在整个生产过程、包装系统中减少含硅油组件的使用等。

综上所述，随着质量源于设计(QbD) 理念的深入，药物研发者在药物的研发设计时，尽量避免出现由辅料引起的蛋白源性的可见异物/不溶性微粒风险。若在临床试验期间或产品上市后识别到颗粒物产生的风险信号，应首先明确可见异物/不溶性微粒增加的原因，判断其结构及组成; 其次可根据历史数据回顾分析结果，结合毒理学甚至临床安全性数据对新增可见异物/不溶性微粒对药物的安全性影响进行全面评估，基于安全性评估结果，结合分析方法研究及方法学验证结果，制定可见异物/不溶性微粒的可接受标准及明确依据，特别是在稳定性考察中关注可见异物/不溶性微粒变化; 同时，制定有效的措施降低或消除风险，最终消除可见异物/不溶性微粒的形成。