摘  要 

介绍原料药(active pharmaceutical ingredient，API)中基因毒性杂质控制的法规要求、评估方法和控制方法。方法 通过学习欧美法规发展历史，理解国际高端市场对基因毒性杂质控制的监管期望，提出原料药中基因毒性杂质风险评估方法。结果与结论 企业基于半定量评估，结合清除研究数据，建立科学的控制策略，使实际工艺中所有可能涉及的基因毒性杂质风险得到明确鉴别和控制，是达到监管期望的有效途径。

基因毒性物质是指能直接或间接损害DNA，导致基因突变或癌症的物质。基因毒性物质对DNA 的损害作用包括染色体断裂、DNA 重组、DNA 复制过程中共价键结合或插入，也包括通过激活细胞产生基因毒性物质而产生的突变。

随着基因毒性杂质法规逐步健全，药政官方对基因毒性杂质的监管要求越来越高。近些年，在产品的上市申请中，由于基因毒性杂质控制不合规而导致的缺陷越来越多。充分的基因毒性杂质研究已经成为产品能否上市的关键。本研究通过考察法规形成的历史事件和演变过程，深入理解目前监管机构对基因毒性杂质的立场，并针对企业现状，提出原料药(active pharmaceutical ingredient，API)中基因毒性杂质评估和控制的建议。

1、法规研究年

1.1 欧洲对基因毒性杂质的监管

2000 年，欧洲监管机构率先开始关注基因毒性杂质，PharmEuropa 发表了一篇文章，提到注意在成盐工艺中，磺酸在乙醇溶液中形成磺酸酯的潜在风险。当时，该刊物仅要求“进一步信息”来理解该物质形成的风险，包括评估检测方法和安全指标的设立。这个事件被视为具有里程碑意义，标志着专注于基因毒性杂质风险评估和控制的一个新时代。

2002 年12 月，代表EMEA 安全工作组(SafetyWorking Party，SWP)的专利药物委员会(Committee for Proprietary Medicinal Products，CPMP；现为人用药物委员会Committee for Human MedicinalProducts，CHMP)发布了一份关于基因毒性杂质的意见书。指南中将基因毒性杂质的限度分为两类：①有足够证据来支持阈值机制的基因毒性杂质，这些杂质存在一个清晰可辨的限度，低于该限度，则不能观察到显著的毒理作用，因此，可以采用ICH Q3C(R5)中二类溶剂的方法进行控制；②没有充分阈值机制证据的基因毒性杂质。这些杂质应当采用“最低技术可行”(as low astechnically feasible，ALATF)的原则进行控制。

虽然这种方法在大部分案例中均被接受，但是缺乏阈值评估的数据。因此，在2004 年发布的基因毒性杂质限度指南(草案)中，对意见书进行了重大修改。草案采用“最低合理可行”(as low as reasonably practical，ALARP)代替ALATF，默许全面消除风险的概念是无法实现的，因此建议采用毒理学关注阈值(threshold of toxicologicalconcern，TTC)限度(1.5 μg·d1)[4]作为基因毒性杂质的可接受限度。具体含义为在人的一生(70 岁)中，每天摄入1.5 μg 基因毒性杂质，其致癌的风险是可接受的(<1/100 000)。基因毒性杂质可接受限度(ppm)=TTC 限度(μg·d-1)/ 药物的最大日剂量(g·d-1)。

TTC 推算条件如下：通过最敏感物种和最敏感部位数据，建立50%肿瘤发生率剂量TD50；从含有730 种致癌物的数据库中筛选一子类，此数据库能够充分估计口服剂量的TD50；从TD50 到10-6 简单线性外推；假定在高剂量时产生肿瘤的所有生物学过程外推500 000 倍时均呈线性；未考虑细胞保护、DNA 修复、细胞凋亡和细胞周期控制过程的可能性影响；假定无剂量响应阈值，对所有的化合物进行分析。

因此，TTC 是一个非常保守的限度。TTC 概念的应用允许在无任何体内数据时，在足够的安全性基础上建立杂质控制限度。TTC 概念的应用有利于患者、企业和监管机构，使他们避免做不必要的毒理研究和安全性评估。然而，该草案没有明确短期临床实验中的容许限度，使得在某些短期临床研究中，也被迫接受1.5 μg·d-1 的终生暴露限值。因此，在行业发展的要求下，“阶段化”TTC 概念也应运而生。

美国药物研究和制造商协会(PharmaceuticalResearch and Manufacturers of America，PhRMA)由Lutz Mueller 领导的一个专家小组，于2006 年1 月PhRMA 发布白皮书，开发了一套基因毒性杂质检测、分类、界定和独立风险评估的程序。根据积累剂量定义暴露风险的原则，提出了阶段化TTC 概念，详见表1。

值得注意的是该方法在计算暴露时间在12 个月以下的情况时，采用1/1 000 000 的风险概率来代替标准TTC 相关的终生暴露的1/100 000 概率。此外，白皮书还将基因毒性杂质分为5 类，见表2。

2006 年6 月，EMEA 颁发了关于基因毒性杂质限度指南的最终版[7]，并在2008 年由CHMP 安全工作组(CHMP Safety Working Party, SWP)发布Q&A[8]，对指南中的一些问题进行了澄清和确认。这些澄清和确认为业界提供了非常重要并具有可行性的指南，表现在以下几个方面。

①阶段化TTC 限度。SWP 明确临床研究中持续调整TTC 限度是可接受的，并且对Lutz Mueller提出的阶段化TTC 限度进行修改，详见表3。

SWP 声明这些限度仅适用于临床研究阶段，而不能机械地用于短期使用的市售产品。但对于急用于治疗的申请，考虑到产品的特定风险和收益，可在其上市申请中提出此类控制限度，在审查过程中，再建立批准市售产品的特定产品限度。

②指南对现有产品的适用性。对于现有产品是否需要重新评估基因毒性杂质的问题，EDQM通过药典出版物讨论了药典专论的适用性，声明：“已彻底评估了包括在近年来授权的药品中的物质的安全性，并鉴于他们使用的经验，需要追溯调整基因毒性杂质的政策被认为是不需要的，除非有具体关注的原因”。欧洲药典委员会认为一个产品在接受市场监管的时候应该对可能存在的基因毒性杂质进行评估，这是建立一个新产品各论的基本要求。欧洲药典在建立或修订药典各论的时候，要求提供现实可行的基因毒性杂质控制途径，详见表4。

③多个基因毒性杂质的控制。SWP 声明：当多个基因毒性杂质存在于原料药中时，只要杂质结构(指警示结构)不相关，1.5 μg·d-1 的TTC 限度可应用于单个杂质。

④避免使用和ALARP。SWP 通过Q&A 文件确认，如果已证明产品或物质可控，则无需进行额外的工作以进一步降低基因毒性杂质的水平。也就是说，只要保证产品的质量和安全性可接受，并不需要完全避免在工艺中使用基因毒性物质，因此，在工艺中控制和不回避是产品和工艺开发的基本要求。

⑤ICH 鉴定限度和基因毒性杂质评估的关系。关于怎样将ICH 鉴定限度与未知杂质联系起来，怎样将鉴定限度和基因毒性杂质评估联系起来的问题，SWP 提供的答案是确认ICH Q3a 概述的鉴定限度仍然是适宜的，主要是因为原料药的总体质量已经在工艺路线上有明确合理的风险评估支持，这有助于鉴别显著潜在的主要风险。该风险评估可以保证原料药的质量，并意味着那些低于鉴别限的未知杂质不太可能具有潜在基因毒性。

在基因毒性杂质情况未知时，可以参考ICHQ3a 的鉴定限度对产品建立有关物质指标。但也需要对所有杂质进行基因毒性评估，评估结果发现没有基因毒性杂质或者所有基因毒性杂质都已经被清除，则不需要在产品质量标准中增加基因毒性杂质的限度，而只采用一般杂质的有关物质指标即可。

1.2 美国FDA 对基因毒性杂质的监管

EMEA指南和随后的Q&A在技术上仅适用于欧洲。FDA 虽然在口头上表示支持EMEA 的基本原则，但直到2008 年底，FDA 的立场仍比较模糊。在2008 年12 月，FDA 终于公布了他们期待已久的基因毒性杂质主题的指南草案。

不出所料，FDA 指南草案和EMEA 指南在关键原则方面保留大部分相似，如认可阶段化TTC限度和使用SAR 评估方法。不过也存在一些显著差异，例如FDA 建议引入不同患者群的下限，特别是儿童群；对于任何高于ICH 鉴定限度的杂质，不论其是否具有警示结构，均应对分离的杂质进行特定的基因毒性测试；对于EMEA 在Q&A 中修改的避免和ALARP，FDA 并不采纳，而是直接套用EU 指南；在阶段化TTC 应用中，FDA 支持延长120 μg·d1 的限度应用到非常短(不到14 d)的研究中，等等。

ICH 对基因毒性杂质的行动：同时满足欧美两个不同的指南，对企业来说是个挑战。因此ICH正着手修订关于基因毒性杂质的指南M7，并于2013 年2 月6 日发布了第二阶段征求意见稿，其中对阶段化TTC 及API 中GTIs 的控制方法均进行了定义，同时，也提出了对工艺中涉及的基因毒性杂质进行风险评估的4 种控制策略，指出需要对原料药工艺中涉及的基因毒性杂质进行科学的风险评估，包括对影响杂质命运的各种因素进行评估，包括化学活性、溶解性、挥发性、电离性及其他物理操作步骤对杂质去除的影响等。

2.原料药中基因毒性杂质的评估

2.1 原料药企业对基因毒性杂质的研究现状

随着监管机构对合成类药物中基因毒性杂质的控制期望不断提高，制药企业越来越多地收到基因毒性杂质研究不足的缺陷信。EDQM 自2006年以来每年都发布上一年度申报资料中存在的十大常见缺陷问题报告[11]。作为基因毒性杂质监管的倡导者，EDQM 在其历年汇总的TOP10 缺陷条款中，多次提到基因毒性杂质研究不足的缺陷，从最近2011 年的前三大缺陷条款中可以看出，基因毒性杂质的控制不充分是首当其冲的问题，见表5。因此，为了新产品成功上市，制药企业必须先解决产品中基因毒性杂质的控制问题。

可见，基因毒性杂质的监管已经是欧洲申报文件审评的重中之重，同时也反映出，原料药企业在申报产品前，对基因毒性杂质的研究还远远不够。具体表现在以下几点：

①对工艺路线中所涉及的基因毒性杂质来源评估不全面。没有全面考虑起始物质、试剂、溶剂等可能带入的基因毒性物质，对工艺过程中可能产生的基因毒性杂质也没有充分评估。

②对基因毒性杂质的结构和毒性评估不充分。表现为将基因毒性杂质等同于一般杂质，在建立质量标准时，没有充分评估杂质是否具有基因毒性或致癌性。

③对基因毒性杂质的控制不充分。表现为在质量标准中按单个未知杂质处理，控制在0.10%限度以下；或者在连续3 批原料药产品中检测基因毒性杂质，得到检测结果<30% TTC 限度，即认为产品中不存在基因毒性杂质，而取消产品质量标准中的常规检测等。

④充分的基因毒性杂质研究需要克服以上缺陷，从基因毒性杂质的来源、结构、分类等方面进行评估，确定工艺中需要控制的基因毒性杂质，并在充分理解产品质量和工艺原理基础上，采取科学的方法，对工艺中的基因毒性杂质进行控制。

2.2 原料药工艺中潜在基因毒性杂质来源的评估

评估合成路线，侧重于起始物质、中间体、试剂、催化剂、溶剂、副反应产物和降解产物等。对此，EMEA 建议“应基于扎实的科学评价，全面考虑参与合成的化学反应、原辅料中可能带入新原料药的杂质和可能的降解产物，确定最有可能在新原料药的合成、纯化和贮存期间出现的实际和潜在杂质。”

可能出现在API 中的潜在基因毒性杂质一般可分为以下几类：

①未反应的具有警示结构的物料或中间体(如含氮杂环API 中未反应的硝基芳香化合物，由于不完全氢化作用或位置异构体无法环化)。

②与包含警示结构的物料、中间体或API 本身密切相关的物质(如在工艺中用盐酸处理后的含羟烷基的API 的氯烷基类似物)。

③通过溶剂和试剂两者之间的相互合成作用，或与原辅料或中间体的合成作用形成(如由于在磺酰氯的反应中，使用了异丙醇脱氧腺苷酸羟基中间体而形成了异丙醇甲苯磺酸盐)。此外，在API 开发阶段，风险评估还需考虑来源于生产期间或API 长期贮存期间的降解物。

2.3 基因毒性杂质的结构评估

EMEA 和FDA 指南草案都认为使用结构评估是一种有效的方法，可通过它进行基因毒性潜在性的评估。常用的结构评估商业软件是DEREK和Mcase，这两个系统费用昂贵，小公司也可使用基于Ashby 和Tennant 警示的简单系统，详见图1。

2.4 基因毒性杂质的分类

一旦完成了结构评估，每个杂质应根据其基因毒性危害进行分类。Lutz Mueller 等确定的5 类分类方案已被广泛用于这个目的，见表2。

此外，SAR 评估程序也是有缺陷的，采用SAR评估程序并不能全面覆盖所有基因毒性杂质。因此需要根据安全性测试(Ames 测试)，单独评估这些杂质。如果杂质没有基因毒性标记，但在工艺中作为亲电试剂使用，仍需通过数据库查询确定其是否具有基因毒性，比如美国医学图书馆提供的TOXNET 数据库，可通过共同的门户网站来访问一系列数据库，如有害物质数据库(HazardousSubstances Databank，HSDB)、化学致癌作用研究信息系统(Chemical Carcinogenesis ResearchInformation System，CCRIS)和集成风险信息系统(Integrated Risk Information System，IRIS)等，提供了许多常见化学品的安全性数据。另一个相关的系统是Berkeley 数据库。实际上，采用足够的数据库对化合物特定的成分进行基因毒性风险评估是经常的做法，而不是简单使用TTC 限度进行控制。

2.5 杂质潜在遗留的风险评估

一旦确定具有潜在基因毒性的杂质，下一步就是考虑这些杂质带入原料药中的可能性。由于基因毒性杂质经常是高活性的，能够通过下游工艺去除，因此，可以结合杂质的理化性质，在下游工艺处理中采用适当的方式把它们去除。例如，生产工艺中经常遇到的酸性、碱性条件下可分解或去除杂质，或者下游工艺中所用的其他试剂可与基因毒性杂质反应，使其不易反应，从而“安全”。以下针对基因毒性杂质的不同性质，提供可行的工艺去除方法。

2.5.1 反应活性 

许多基因毒性杂质均具有高反应活性，例如酰卤化合物，因其极易反应，使得在反应结果中监测它们几乎无实际意义。而且，如果有任何残留，可以通过某些方法有效地去除，如水淬灭或对所得产物的简单水洗。

在工艺中，存在某些残留物可能残留在中间体中的可能性。对于这些化合物，在随后的工艺步骤中具有高概率的反应，例如，在合成早期考虑使用烷基卤，另一个烷化剂应在下游工艺中使用，则早期使用的烷基卤残留很可能消耗在后面阶段，见图2。该工艺中，第一阶段用到的烯丙基溴残留到第三阶段，如果仍然存在，将反应生成预期产物的烯丙基类似物。

基因毒性化合物的反应活性可按表6 分类，该表只作为一个参考，具体情况应根据实际工艺的化学反应来评估。

2.5.2 溶解度-分离阶段 

许多高度亲电(往往是基因毒性)的试剂、中间体常常用于优化产量和提高产品质量的合成工艺中，并常常在溶液中完成反应步骤。这便意味着基因毒性反应物很可能高度溶于所选择的溶剂。因此，当工艺中将反应产物分离为固体时，基因毒性反应物被残留在反应母液中而除去，这可进一步通过用一种基因毒性试剂易溶而反应产物不溶的溶剂洗涤滤饼，而彻底去除基因毒性反应物。这种情况下，基因毒性试剂的溶解度应在置换溶剂中评估，以便确定合适的清除因子。

2.5.3 挥发性 

许多可能在典型的合成工艺中遇到的基因毒性物质是挥发性的，包括低分子量烷基卤、醛、氮/硫卤乙基芥。常用蒸馏方法来降低或完全去除存在的反应溶剂，因此也可有效地降低或消除残留的基因毒性杂质。这取决于基因毒性相对于溶剂沸点的挥发性。

2.5.4 电离度 

芳香胺是含能电离基团的潜在基因毒性物质的最好例子。大部分API 和中间体均具有潜在的电离。这种情况下，关注基因毒性物质和基质间可能存在的的电离度差异，便能通过改变水相的pH 值并萃取有机相，来降低基因毒性杂质的水平。

硝基化合物还原至胺便是此类工艺的一个很好的例子。虽然它们具有一个共同的基因毒性代谢物中间体(一个正氮离子)，但是可能发现讨论中的硝基化合物具有基因毒性，而其胺类似物则可能没有。在这种情况下，需要去除硝基前体物，特别是如果相关的硝基化合物在下游工艺中不活泼，使得它可能以原形完成该工艺。

对于过量硝基化合物的去除，可以通过使用酸性水层的双相系统，通过液液萃取来实现。任何非电离的硝基化合物将残留在有机相中，而可电离的胺将残留在水层中。弃去有机层，胺则在碱化后在新有机溶剂层中简单地反萃取。

在合成常见的止痛药对乙酰氨基酚中，倒数第二阶段涉及将4-硝基酚还原至相应的胺，反应混合物用甲苯萃取，碱化，再萃取胺。

2.5.5 色谱法 

从通过硅酸床的简单过滤，到制备型液相色谱法，色谱法为API 或中间体中基因毒性杂质的去除提供了多种选择。

制备型液相色谱法一般采用正相模式，即采用极性固定相(一般为硅酸)和非极性流动性(有机溶剂系统)。这与分析型液相色谱法不同，因为大部分分析色谱法都是在反相模式中进行的。制备型液相色谱法采用正相模式是出于分离化合物的需要——使用易被除去的挥发性溶剂。也可以使用反相模式，但是除去基于水性溶剂系统的困难限制了适用范围。

Bandichhor 等报告了利扎曲坦的纯化，利扎曲坦是一种5 羟色胺-HT 受体激动剂，其合成工艺中生成的基因毒性二聚合物杂质不能通过普通的工艺去除，通过分步结晶和重结晶工序，不能达到0.01%的限度。因此，使用适当的pH 值和离子强度改性来开发反相法，增加利扎曲坦和基因毒性二聚合物之间的选择性。基因毒性二聚合物强烈地保留在柱子上，经过优化的负载率达到最大生产率，而没有任何可察觉的基因毒性二聚合物带入到产品中。作者报告了基因毒性二聚合物水平从约40 000 ppm 减少到40~80 ppm( 产率>95%)。

2.5.6 重结晶 

重结晶是去除API 或中间体杂质，包括基因毒性杂质的最有效方法之一。采用该方法需要选择一种适合的溶剂，使API 或中间体在高温情况下高度溶解，而冷却时几乎不溶。高温条件下通过过滤，去除不易溶于热溶剂的杂质，而较易溶于冷溶剂的杂质保留在冷却后的溶液中，通过过滤分离。

2.5.7 其他技术 

除以上技术外，还可通过其他手段去除基因毒性杂质，如活性炭和树脂。活性炭结合重结晶工艺，可非常有效地去除有色杂质。而树脂去除法类似于萃取和分离技术，使基因毒性杂质吸附在树脂上，而所需产品保留在溶液中，从而通过过滤除去杂质。

2.6 应用加标、清除法进一步风险评估除了

上述理论风险评估外，还需要通过加标清除法定量工艺对基因毒性杂质的实际去除能力。加标(spiking)指的是以固定的数量加入需要研究的基因毒性物质；清除(purging)指的是下游工艺去除目标杂质的能力。

Liu 等摸索了加标/清除研究的使用，报道了一种新型的抗肌瘤产品，盐酸帕唑帕尼的5 个潜在基因毒性杂质的分析控制策略见图3(基因毒性杂质用盒括标识)。

讨论中的杂质中的每一个以高水平(某些情况下高达5%)加标至工艺中。然后使用杂质预定命运图以证明下游产品中水平的连续降低。例如，第1阶段产品含670 ppm 化合物ii，第2 阶段产品23 ppm，而第3 阶段产品中间级API 和最终API含不到1.7 ppm(化合物ii)。这使他们集中于起始物料或中间体的上游控制，并避免需要在制剂中进行控制。这种方法的吸引力是它允许控制限度

设定在较高水平，并保证下游的清除将降低相关物质的水平至可接受水平。它也允许控制策略基于不太复杂和灵敏的分析方法，这些方法更与常规质量控制环境有关。

3.结论

药品中基因毒性杂质控制的主要挑战是将杂质的危害最小化和企业开发药品成本之间的平衡。药物研发过程中增加基因毒性杂质的研究，包括限度的设定、分析方法研究、验证以及常规检测都将严重拖长药品开发完成的时间线。基因毒性杂质研究需要更多的时间和资源，延迟药品上市时间，并增加药品研发成本。因此，在药物研发过程中应用强大的风险评估来平衡患者用药安全性及企业的生产控制成本，采用合适的手段控制产品中的基因毒性杂质，是非常必要的。

EMEA 和FDA 草案指南以及ICH M7 草案都明确要求充分评估基因毒性杂质的风险，控制原料药和药品中基因毒性杂质的残留限度。为了满足监管要求，达到产品顺利上市的目的，笔者认为企业基于半定量评估，结合清除研究数据，建立科学的控制策略，使实际工艺中所有可能涉及的基因毒性杂质风险得到明确鉴别和控制，是达到监管期望的有效途径。