抗体药物的结构具有显著的异质性，正确的分子结构是保证抗体药物安全有效的物质基础。在质量研究中，对抗体药物进行全面的表征分析是进行质量控制的重要手段。其中，纯度作为抗体药物的一项重要检测指标，直接反映了抗体纯化工艺的水平以及产品质量的高低。

图1 抗体药物异质性的原因及表征方法

大小异质性一般分为三类，即单体、片段和多聚体。片段包括降解的单抗和组装不完全的重轻链等，而多聚体则包括二聚体、寡聚体和更复杂的聚体等。多聚体不仅是单抗中的非活性成分，同时也是引发单抗免疫原性的关键因素之一，因此大小异质性是单抗生产工艺优化、生产过程控制及放行分析中不可或缺的检测项目，也是评价单抗稳定性的重要指标之一。

随着技术的不断进步，单抗大小异质性的分析手段日益丰富。不同的分析技术基于不同的原理，能够揭示单抗在大小异质性方面的不同特性。其中，分子排阻色谱法（SEC-HPLC）和毛细管电泳法（CE-SDS）因相对简单易行，已成为分析单抗类制品大小异质性的两种常用方法。本文主要阐述分子排阻色谱法的原理及注意事项。

分子排阻色谱法（Size Exclusion Chromatography，SEC），也被称为空间排阻色谱或凝胶排阻色谱，是在20世纪60年代初发展起来的一项分析技术。《中国药典》2005年版将此法收入药典附录中，此版药典收载该法的药品品种相对较少，不足20个。然而《中国药典》2020年版收载该法的药品已有近百种，其中二部收载了近80种药品，该法主要用于抗生素聚合物的检测、分离以及大分子物质的分子量及分子量分布的测定。在三部中，该技术被应用于重组乙型肝炎疫苗、胰岛素等9个品种，主要用于高分子蛋白质的检查、蛋白聚合物的检测等。此外，四部有16个原辅料品种也收载了此法，主要用于分子量分布的测定及大分子物质的含量测定等。从药典收载的变化情况来看，分子排阻色谱法的应用日益增多。

原理

分子排阻色谱法的分离原理为凝胶色谱柱的分子筛机制。其根据待测组分的性质一般可以分为凝胶过滤色谱法-GFC( 采用水溶液或缓冲液作为流动相) 和凝胶渗透色谱法-GPC( 采用有机溶剂作为流动相) 。

色谱柱常用的填料有分子筛填料、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶和玻璃珠等，目前，基于凝胶的柱填料使用最为广泛，药品检验中常用的填料是葡聚糖凝胶 Sephadex G-10。填料表面分布着大小不同的孔径, 药物分子进入色谱柱后,不同组分按大小进入相应的孔径内。分子量大于所有孔径的分子不能进入填充剂颗粒内部，因此在色谱过程中最早被流动相洗脱至柱外，保留时间较短；分子量小于所有孔径的分子能自由进入填充剂表面的所有孔径，在色谱柱中滞留时间较长，保留时间较长；其余分子则按分子量大小依次被洗脱。

图2 不同分子量的物质分子排阻洗脱示意图

注意事项

1.色谱柱不耐高压。SEC的分离原理基于不同大小组分在填料中孔道路径上的差异，因此SEC填料需要较大孔容积来确保分离效果。孔容积越大，有效“分离窗口”越宽，分离效果就越好。然而随着填料的孔容积的增大，其机械强度也越差，因此相比常规的C18色谱柱，所装填的SEC色谱柱的耐压性较差。在使用SEC色谱柱时，建议逐步缓慢提升流速至实验所需水平，降低色谱柱由于升压过快导致柱床塌陷的风险。

2.当启用一支全新的SEC色谱柱时，初期可能会观察到第一针峰值的响应较低。然而，随着连续的进样，信号响应会逐渐增强并最终趋于稳定。这种现象在生物大分子色谱分析中屡见不鲜，其主要原因是色谱柱的筛板、柱管和填料中含有一定数量的活性位点。这些活性位点具有吸附特定性质生物大分子的能力。例如，在进行单抗聚体分析时，初始阶段可能会发现聚体峰面积逐步增大，一旦所有未知的活性位点被蛋白质完全屏蔽后，样品中所有组分的峰面积就会达到稳定状态。

3.分子排阻色谱柱的体积通常较大，长度较长，和高效液相色谱仪联用时，个别色谱柱无法顺利安装进柱温箱，只能在室温下进行样品检测，无法对柱温进行有效的控制调节。

4.分子排阻色谱法通常采用水溶液或缓冲溶液作为流动相，这样的环境容易滋长微生物，因此，在需要长时间使用的情况下，通常需要在流动相中加入抑菌剂以防止微生物的滋生。

5.在SEC的流动相中加入适当浓度的盐（通常在50-100mM范围内），可以有效避免分析物与固定相之间的二级作用，进而改善色谱峰形。尽管盐的浓度上限是1M，理论上更高浓度的盐并不会损坏色谱柱，但随着盐浓度的升高，蛋白质与固定相之间的疏水作用也会增强，导致蛋白质的溶解度降低，引起柱压升高。因此，在实际应用中，需要权衡盐浓度对峰形改善和潜在副作用的影响，以选择最佳的色谱条件。

6.在SEC的流动相中，需严格控制有机溶剂的比例。当有机溶剂的比例过高时，硅胶基质的SEC柱的保留机理将逐渐转变为HILIC，而不再完全取决于分析物的分子量。