无菌保证水平是注射剂的关键质量属性之一，对注射剂的安全性有至关重要的影响。复杂注射剂是一类复杂的载药系统，包括微球、脂质体、乳剂、混悬性注射剂等。其结构复杂、组成成分复杂、制备工艺复杂，其灭菌工艺的选择也成为复杂注射剂成药的挑战之一。本文结合现有文献及相关经验对复杂注射剂灭菌工艺进行一些总结，以期为复杂注射剂灭菌工艺的开发提供参考。
一、复杂注射剂灭菌工艺
1.湿热灭菌
指将物品置于灭菌设备柜内利用高压饱和蒸汽、蒸汽-空气混合物、蒸汽-空气-水混合物、过热水喷淋等手段使微生物菌体中的蛋白质、核酸发生变性而杀灭微生物的方法。该法灭菌能力强，为热力灭菌中最有效、应用最广泛的灭菌方法。也是注射剂首选的灭菌方法。
脂质纳米粒子和自组装纳米粒子，以及那些玻璃化转变温度和熔点低于120℃的纳米粒子，都最容易受到湿热的影响。在此过程中温度的升高和冷却都会导致纳米颗粒分子结构的重排，引起纳米颗粒的聚集、磷脂的氧化和水解、相转变、被包封药物的降解和泄漏等许多理化性质变化。因此，对于大多数的纳米粒子药物来说，湿热灭菌是无法实现的，但仍然可通过选择高相变温度和高熔点的处方、降低灭菌温度延长高压灭菌时间，来尝试进行湿热灭菌。例如：Kikuchi等制备了多种脂质体进行湿热灭菌，结果表明若由低过氧化值的脂质形成的荷电脂质体分散在pH接近6.5的等渗的糖或多元醇溶液中,溶液中溶解氧的量降到最低,且是离子型水溶性药物包载在带相反电荷的脂质体中,则对其进行热力灭菌是可行的。
对于高温条件下不降解、结构不发生改变的复杂注射剂首选湿热灭菌，例如一些耐高温的乳剂、混悬剂等。但由于此类注射剂多为热力学不稳定体系，为避免分层、沉降，湿热灭菌最好选用旋转式灭菌锅进行。
2.辐射灭菌
辐射灭菌是利用电离辐射杀灭微生物的灭菌方法，用于灭菌的电磁波有微波、紫外线、γ 射线、X 射线等。目前多采用60Co 源放射出的γ射线。
辐射可以诱导纳米颗粒的降解和/或物理化学变化，如纳米颗粒辅料聚合物和脂类结构的交联和链断裂。这些变化会影响纳米颗粒释药速度。降解产物溶血磷脂、游离脂肪酸等均可影响制剂的安全性。另外，如果药物中含有水，就会导致一系列自由基反应。这些自由基既可以与纳米颗粒基质相互作用，也可以与负载药物相互作用，导致药物结构的物理化学变化。
通过冷冻干燥去除水分，使用抗伽马辐射赋形剂，并在配方中加入自由基清除剂可以减轻辐射对制剂降解的影响。此外，在辐照过程中去除氧或应用真空可以通过减少自由基的形成来减少辐照引起的降解。
辐射灭菌有以下优点 ：①常温灭菌，适用于对热敏感的生物制品和药物的灭菌②在密封包装条件下灭菌，产品可以长期保持无菌状态。③辐射的穿透力很强，其灭菌也彻底，且不受物品包装及形态的限制。因此，对于一些固体冻干类的制剂可以尝试进行辐射灭菌。
陈新梅等选择了湿热灭菌、紫外灭菌、辐射灭菌等5种不同的方法对氟哌酸微球制剂进行灭菌，结果表明60Co辐射灭菌是确保药品安全有效的方法。石杉碱甲微球采用60Co照射γ射线灭菌，10,15,20 kGy的辐射剂量对微球的外观、含量及释放度无明显影响。然而，由于辐射灭菌可能会产生一些意想不到的降解产物，如果需要使用辐射灭菌，制剂的安全性需要重点考虑。
3.过滤除菌
指采用物理截留去除气体或液体中微生物的方法。常用于气体、热不稳定的药品溶液的除菌。过滤除菌工艺开发时，应根据待过滤介质属性及工艺目的选择合适的过滤器。除菌级过滤器的滤膜孔径选用 0.22μm（或更小孔径或相同过滤效力）。
无菌过滤是热不稳定液体制剂灭菌的最常用方法之一。然而，这种方法受到药物粒径的限制，从理论上来看，只有粒径小于0.22μm的复杂制剂才能适合除菌过滤，因此适合粒径小分布窄的产品。此外，溶液的粘度也是限制该方法使用的一个因素。高粘度溶液需要更高的过滤压力和过滤时间，有可能导致纳米粒中药物的泄露。在不影响药物结构和释放的情况下，一些产品可以通过提高温度来降低粘度，从而保证产品的顺利过滤。
滤膜对药物的吸附和兼容性也是考虑的重点，因此，需要进行滤膜兼容性、吸附性考察及除菌过滤参数的验证，确保过滤工艺的无菌保障水平。由于微生物通过除菌过滤器的概率随着待过滤药液中微生物数量的增加而增加，最终除菌过滤前，待过滤药液的微生物负荷一般小于等于 10cfu/100ml。
4.全无菌工艺
当上述方法都不适用时,则应进行无菌操作。例如SkyePharma公司以DepoFoam技术为基础开发研制了阿糖胞苷多囊脂质体(DepoCyt)和硫酸吗啡多囊脂质体(DepoDur)。两者均为热敏药物脂质体，且多囊脂质体在结构上不同于常规脂质体,内部脂膜以非同心圆形式存在,外观像泡沫,粒径更大(5～ 100μm,中间粒径为10～30μm),不适合于终端灭菌,因此在制备时必须要无菌操作。然而，无菌操作对车间环境、人员操作要求较高，生产成本也大大提升。
二、复杂制剂灭菌工艺选择考虑
1.理化性质:
复杂注射剂是一个具有多个组成部分的复杂系统，湿热灭菌过程的高温会导致原辅料的降解，杂质增大，影响用药安全性。过滤除菌对于具有粒径的低粘度配方是有用的，可以通过0.2 um的过滤器，但该过程可能导致药物的吸附和泄露。此外，伽马辐够诱导自由基级联反应和产生细胞毒性杂质。因此，选择最合适的灭菌技需要根据产品可接受的降解水平、药物损失和产品的保质期来选择。
2.药品装量：
按照《注射剂无菌保证工艺研究及评价的原则》要求大容量注射剂（大于50ml）
（1） 应采取终端灭菌工艺，建议首选过度杀灭法（F0≥12），如产品不能耐受过度杀灭的条件，可考虑采用残存概率法(8≤F0<12)，但均应保证产品灭菌后的SAL不大于10-6。采用其它F0值小于8的终端灭菌条件的工艺，原则上不予认可。
（2） 如产品不能耐受终端灭菌工艺条件，应尽量优化处方工艺，以改善制剂的耐热性。如确实无法耐受，则应考虑选择其他剂型，而非大容量注射剂。
3.生产批量
无论灭菌方法如何，小批量批次都可以轻松处理。然而，当批量增时，可能会改变灭菌的成本、时间和方法的有效性。
对于湿热灭菌可能需要多批次分别灭菌。需要对灭菌设备载量和灭菌效果进行充分的验证。
对于除菌过滤方式而言，大批量过滤需要考虑滤膜的通量，可能需要更大的过滤系统和更昂贵的附件。此外，随着过滤时间延长，压力增大，可能会影响产品的粒径、泄露率、含量等关键质量属性。
4.可及性
辐射灭菌用于注射剂产业化生产灭菌并不常见，可以进行注射剂辐射灭菌的设备不像其他灭菌设备可以在实验室和车间内自由安排。因此如果考虑辐射灭菌工艺，建议尽早确定灭菌的地点、产品运输及灭菌流程，并及时跟CDE进行沟通交流。
综上所述，复杂注射剂的灭菌工艺应依据每种产品的不同情况多方考虑。不管采用何种灭菌方式，都需要对灭菌后产品的粒径、泄露率、降解杂质、含量、稳定性等关键质量属性进行考察。同时，在研发初期产品处方和工艺设计阶段就要考虑灭菌对产品的影响，从而开发出即满足无菌保障要求又质量可靠、稳定性良好的复杂注射剂。
参考文献：
[1]Bernal-Chávez SA, Del Prado-Audelo ML, Caballero-Florán IH. Insights into Terminal Sterilization Processes of Nanoparticles for Biomedical Applications. Molecules. 2021 Apr 3;26(7):2068
[2]Subbarao, Nanda. Nanoparticle Sterility and Sterilization of Nanomaterials. (2016).
[3]Delma KL, Lechanteur A, Evrard B, Semdé R, Piel G. Sterilization methods of liposomes: Drawbacks of conventional methods and perspectives. Int J Pharm. 2021 Mar 15;597:120271.
[4]陈新梅,邢君芬,李秀莲等.辐射灭菌对氟哌酸微球制剂影响的实验研究[J].中国药房,1995(03):8-9.
[5]邓艾平,彭丽君,王奕等.辐射灭菌对石杉碱甲注射微球药剂学性质的影响[J].中国医院药学杂志,2009,29(24):2069-2071.
[6]徐盛杰,涂家生.脂质体灭菌方法综述[J].药学与临床研究,2009,17(02):120-124.
