在色谱方法开发过程中，高柱效、高分离度是一贯追求的目标，而色谱柱和流动相的选择特别地被关注。流动相是影响高效液相色谱（HPLC）性能的重要因素，其性质包括有机溶剂的种类、配比和pH值等，对保留时间、峰形和分离度都有影响，这些直接对实验结果产生不可忽视的作用，因此正确的选择流动相是至关重要的。本文探讨了反相高效液相色谱（RP-HPLC）中如何正确快速地选择流动相，并且优化最佳分离条件。
1、 分析样品的组成及性质
在色谱方法建立之初，对样品的化学组成和理化性质要有一定的了解，才能确定与选择出最佳的初始分离模式。
1.1 样品的相对分子质量
考虑到多肽的相对分子质量大和组成复杂，并且其保留行为对有机溶剂比例的微量变化非常敏感，等度洗脱时分离结果的重现性差，白泉等就分别对多肽32、21设计了5、6种线性梯度洗脱方式进行流动相优化，最终各自优化出一种线性梯度方式，分离、纯化和制备出高纯度的两种多肽。样品的相对分子质量对初始条件的选择是有影响的，对于相对分子质量大的样品，如多肽、蛋白质和低聚物等生物大分子，梯度洗脱是最好的选择。对于低相对分子质量的样品，需要通过分析样品性质，如溶解性、分子极性及化合物结构、特殊官能团等，选择适宜的流动相及分离模式。
1.2 样品的溶解度
了解样品在有机溶剂中的溶解度，根据“相似相容”原理，初步判断样品是极性还是非极性化合物。若样品溶解于己烷、庚烷等非极性溶剂时，即为非极性样品，可以考虑使用正相色谱；若样品溶解于二氯甲烷、甲醇、乙腈等极性溶剂时，即为极性样品，考虑的分离模式就是反相色谱。如果样品溶于水，就首先检查水溶液的pH值。
1.3 样品的酸碱性
当样品中有酸或碱性物质时，在实际的RP-HPLC工作中，常加入酸[5]、碱或缓冲液作为离子抑制剂来抑制被测物解离。较常用的是缓冲盐，其不仅可以控制流动相的pH值，还起到提高保留时间的重现性和改善峰形的作用。在用ODS-C18色谱柱分析间苯三酚时，发现当流动相为水-有机相系统时，间苯三酚的峰有严重拖尾现象，峰形较差。分析原因可能是间苯三酚呈弱酸性，在该系统下呈解离状态，最终优化的流动相为乙腈-磷酸盐缓冲溶液（6∶94）。此时主峰与杂质峰完全分离，并且其峰形良好。
1.4 样品的稳定性
用一种简单的RP-HPLC-UV法代替了《美国药典》中阿奇霉素的检测方法，研究中考察了流动相不同pH值时样品的分离情况。当流动相pH值为6时，阿奇霉素峰拖尾严重，这是由于阿奇霉素在酸性溶液中不稳定；当流动相用10% NaOH溶液将pH值调至8时，则获得了良好的峰形，并与其他杂质分离情况良好。因此，选择流动相时，应首先考虑样品在该流动相体系中是否稳定存在。
1.5 对映异构体
当样品中有对映异构体时，就要考虑在流动相中加入手性衍生化试剂或使用手性色谱柱。
2、 改变选择性和分离度
执行初始分离条件时，会出现各种各样的问题，如保留时间过短或过长、分离度达不到要求、拖尾严重等，通过调节有机溶剂和添加剂的性质，可控制选择性和分离度，达到最佳分离效果。
2.1 有机溶剂对分离的影响
有机溶剂的种类和配比决定流动相的极性，即洗脱能力。这对出峰时间、峰形、分离度等有着不可忽视的作用。
2.1.1 有机溶剂比例对分离的影响
初始分离条件中，一般有机溶剂的比例定为80%，然后逐步减少有机相比例，直到保留因子（k）落在所期望值的范围内，即1≤k≤10，再考虑分离度、拖尾因子和出峰时间等，优化出合适的流动相比例。Snyder等在分离4种硝基取代苯混合物时，流动相是乙腈和水，以80%的乙腈作为初始分离条件，其保留时间很短（k＝0.3），并且几种物质的分离度几乎为零；接着改用50%乙腈，样品的保留范围比较合理（0.9≤k≤4.2），但是分离度仍不符合要求，进一步减少至40%乙腈，保留因子范围是4.0≤k≤10，分离度为1.4，仍不符合要求。如果再继续减少乙腈比例，保留因子就有可能大于10，因此就需要采用其他方法来改变选择性和分离度。
2.1.2 有机溶剂种类对分离的影响
如上述Snyder等[11]的分离试验，调整有机溶剂比例仍无法达到要求时，就要考虑换有机溶剂的种类。较常用的是乙腈和甲醇。贾涛[12]以甲醇-水（65∶35）为流动相检测左炔诺孕酮时，不管何种比例，检测出的杂质都比较多，且分离度不符合要求，就考虑用乙腈代替甲醇，结果左炔诺孕酮出峰时间合适，并与其他杂质分离情况良好。
当单独使用乙腈和甲醇都不能满足要求时，就可以考虑将两者混合使用。Kurade等用C18色谱柱，分离雷米普利和替米沙坦时，当单独用缓冲盐-乙腈和缓冲盐-甲醇为流动相时，分离度、拖尾因子和保留时间均不符合要求，考虑用甲醇和乙腈的混合物，最终优化的流动相系统为磷酸二氢钾缓冲液（用磷酸调pH值至3.4）-甲醇-乙腈（15∶15∶70），结果显示雷米普利、替米沙坦的保留时间分别为3.68、4.98 min，二者分离情况良好。
若不能用等度洗脱分离样品时，梯度洗脱是一种非常好的方法。丁素玲等[14]在检测盐酸帕洛诺司琼的有关物质时发现，有一中间体的保留时间是主峰出峰时间的9～10倍，为了缩短分析时间，采用了梯度洗脱，缩短了二者的出峰时间差距，并且分离度也符合要求，减少了时间和试剂的浪费。利用RP-HPLC同时测定阿托伐他汀和7种相关杂质的量，由于8种物质的保留范围宽，考虑梯度洗脱，Petkovska等采用全因子变量设计，通过对有机溶剂比例、有机混合溶剂中四氢呋喃的比例和梯度时间的考察，最终确定了有机溶剂的变化比例是35%～75%，有机混合溶剂中四氢呋喃的比例是10%，梯度洗脱时间是10～20 min。在上述条件下，阿托伐他汀和7种相关杂质分离情况良好。
2.2 缓冲盐对分离的影响
缓冲盐的种类、pH值和浓度直接影响缓冲盐的离子强度，而流动相的离子强度对可解离化合物的色谱峰形具有显著影响，原因在于色谱柱的过载效应随着流动相离子强度的增加而减弱。
2.2.1 缓冲盐种类对分离的影响
《中国药典》中测定头孢呋辛钠中头孢呋辛时，流动相为乙酸盐缓冲溶液（用5 mmol/L乙酸钠和0.1 mol/L乙酸调pH值至3.4）-乙腈（10∶1），与《英国药典》和《美国药典》不同的是用了C18色谱柱，结果峰形呈三角形，拖尾因子、峰宽和分离度均不符合要求。当改用甲酸盐时，同时流动相进一步优化成甲酸盐缓冲液（用80 mmol/L甲酸钠和0.14 mol/L甲酸调pH值至3.4）-乙腈（9∶1），即使用C18色谱柱也能得到较好的峰形，原因在于甲酸的pKa值为3.7，乙酸pKa值是4.7，甲酸的pKa值与流动相的pH值接近。选用pKa值与流动相pH值越接近的缓冲盐，其离子强度越强，即缓冲容量越大，易得到较好的峰形。
2.2.2 缓冲盐的pH值对分离的影响
如上所述，流动相的pH值除了与缓冲盐本身的pKa值有关外，也应该考虑分离样品的pKa值，使样品在该pH值条件下，能以分子状态存在。马志新等依据离子抑制色谱，用反相键合硅胶柱，含18%的甲醇-pH 3.5的50 mmol/L磷酸二氢钾缓冲溶液为流动相，成功分离了含有丁二酸、戊二酸、己二酸的混合二元羧酸。丁二酸、戊二酸、己二酸的各步pKa值均在4～6，用磷酸盐缓冲溶液，调节pH值至3.5，3种酸都以游离状态存在，减弱了与固定相的保留，获得了良好的分离效果。阿托品有叔胺结构，呈碱性，在ODS色谱柱上保留时间很短，张国柱等[22]用磷酸将三乙胺溶液的pH值调至7.5，使阿托品由解离状态转为游离态，从而增加了其在色谱柱上的保留。流动相的pH值高于或低于被分析物的pka值两个pH值单位时，有助于获得尖锐的峰形，化合物99%以一种形式存在[23]。
2.2.3 缓冲盐的浓度对分离的影响
缓冲盐浓度越大，其离子强度越强，对峰形的改善越明显。《美国药典》测定青霉素G钾中青霉素G时，流动相为甲醇-pH 4.3的10 mmol/l磷酸二氢钾缓冲盐，当进样量大时，其峰形拖尾严重。综上所述，pH值为4.3时，缓冲盐的缓冲容量几乎为零，导致缓冲液过载，当用磷酸调pH值至3.5时，峰形有所改善，但仍有拖尾。于是考虑增加缓冲盐浓度，增加至50 mmol/L时，峰形进一步改善。
2.3 特殊的添加剂对分离的影响
当被测化合物带有强离子官能团时，如磺酸基、羧基、胺基和铵基等，在反相色谱柱上几乎无保留，给药物的分离分析带来巨大困难。参考中性化合物，一般在流动相中加入离子对试剂，与被分析组分的离子生成不带电荷的中性离子对，从而增加与固定相的作用，改善了分离效果。
2.3.1 碱性离子对试剂
碱性离子对试剂较常用的是高氯酸盐和烷基磺酸盐。陈红等用C18色谱柱，测定噻托溴铵的两种中间体，即二(2-噻吩基)乙醇酸东莨菪酯和2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯，实验过程中发现：由于两种化合物结构含有极性基团和N、S原子，会部分质子化而带正电荷，与硅胶柱上残留的硅醇基相互作用，当不加离子对试剂时，峰形拖尾严重。因此，在流动相中加入离子对试剂戊烷磺酸钠，形成中性离子，改善峰形和分离效果。王鹛嵩等以C18色谱柱，实验初期选用乙腈-磷酸盐缓冲液和甲醇-磷酸盐缓冲液作为流动相，定量分析血液中二甲双胍的浓度，无论怎么改变有机相比例和缓冲盐性质，二甲双胍的保留时间很短，与血浆中杂质分不开。在酸性条件下，加入十二烷基磺酸钠，得到了满意的分离效果。
另一种分析碱性化合物时，抑制固定相残留硅醇基作用的添加剂是胺，最常用的是三乙胺。El-Enany等用反相液相色谱法测定了格列苯脲片剂的量时，最初始无论是选用的甲醇-水、甲醇-缓冲盐或乙腈-水为流动相，拖尾因子高达2.0。实验证实，流动相中加入三乙胺后，改善了峰拖尾，获得了满意的分离效果。
2.3.2 酸性离子对试剂
《中国药典》中采用高效液相色谱测定氟喹诺酮类药物时，一般用反相柱和磷酸盐缓冲液-甲醇或乙腈作流动相，几乎可适用于所有的氟喹诺酮类药物。考虑到喹诺酮类药物具有两性基团，在水溶液中通常以离子形式存在，与柱填料表面残存的硅醇基有强烈吸附作用，导致色谱峰易出现拖尾现象。根据离子对色谱理论，在流动相中加入反离子对试剂进行分析。孙汉文等将四丁基溴化铵作为离子对试剂加到乙腈-水流动相中，分别以磷酸和三氟乙酸调节流动相pH值至2.87，成功分离了依诺沙星、氟罗沙星、培氟沙星、洛美沙星、环丙沙星和恩氟沙星等7种氟喹诺酮类药物。
3、 结语
对于大多数的研究者来说，流动相的选择和优化是整个色谱方法开发过程中的难点，也是最耗时耗力的一部分。本文仅简单介绍了流动相溶液中的有机溶剂、缓冲盐和一些特殊的添加剂对分离的影响，即在反相高效液相色谱方法建立前，应先分析药物的基本结构，掌握其物理化学性质，特别是药物的极性或解离性和酸碱性，确定初始分离条件，再根据出现的具体问题，结合日常实践经验的积累、相关文献和影响分离的因素，改变选择性和分离度，正确快速地优化出最佳的流动相组成，为实验者选择和优化流动相提供简单参考。
然而对于相对分子质量较大、成分和组成复杂的样品，以及那些中药成分和生物大分子样品，这些是远远不够的，这就需要研究者们在实践中不断总结，不断积累，分享出更多有价值的经验，并且充分利用计算机软件系统，构建一套完整系统的流动相选择优化的理论。
