多肽一般是指少于 100 个氨基酸通过肽键连接而成的化合物，其相对分子质量低于10 000。多肽类药物在治疗肿瘤、糖尿病、心血管疾病、肢端体肥大症、骨质疏松症、胃肠道疾病、中枢神经系统疾病、免疫疾病以及抗病毒、抗菌等方面具有显著的疗效。多肽如何纯化一起来学习下吧。

凝胶过滤的应用

1、生物大分子的纯化图片

凝胶过滤是依据分子量的不同来进行分离的，由于它的这一分离特性，以及它具有简单、方便、不改变样品生物学活性等优点，使得凝胶过滤成为纯化生物大分子的一种重要手段，尤其是对于一些大小不同，但理化性质相似的分子，用其他方法较难分开，而凝胶过滤无疑是一种合适的方法，例如对于不同聚合程度的多聚体的分离等。

2、分子量测定

凝胶过滤测定分子量操作比较简单，所需样品量也较少，是一种初步测定蛋白分子量的有效方法。这种方法的缺点是测量结果的准确性受很多因素影响。由于这种方法假定标准物和样品与凝胶都没有吸附作用，所以如果标准物或样品与凝胶有一定的吸附作用，那么测量的误差就会比较大。计算公式成立的条件是蛋白基本是球形的，对于一些纤维蛋白等细长形状的蛋白不成立。另外由于糖的水合作用较强，所以用凝胶过滤测定糖蛋白时，测定的分子量偏大，而测定铁蛋白时则发现测定值偏小。

3、脱盐及去除小分子杂质

利用凝胶过滤进行脱盐及去除小分子杂质是一种简便、有效、快速的方法，它比一般用透析的方法脱盐要快得多，而且一般不会造成样品较大的稀释，生物分子不易变性。一般常用的是Tandex G-25，并且目前已有多种脱盐柱成品出售，使用方便，可多次使用。

4、去热源物质

热源物质是指微生物产生的某些多糖蛋白复合物使人体发热的物质，它们是一类分子量很大的物质，所以可以利用凝胶过滤的排阻效应将这些大分子热源物质与其他相对分子量较小的物质分开。例如对于去除水、氨基酸、一些注射液中的热源物质，凝胶过滤是一种简单而有效的方法。

5、溶液的浓缩

利用凝胶颗粒的吸水性可以对大分子样品溶液进行浓缩。例如将干燥的Tandex（粗颗粒）加入溶液中，Tandex可以吸收大量的水，溶液中的小分子物质也会渗透进入凝胶孔穴内部，而大分子则被排阻在外。通过离心或过滤去除凝胶颗粒，即可得到浓缩的样品溶液。这种浓缩方法基本不改变溶液的离子强度和pH值。

6、蛋白质的复性

为了减少高浓度下的聚集反应，凝胶过滤层析技术也可以用来进行蛋白的体外复性。层析介质的隔离作用，降低了蛋白之间相互作用产生的聚集，使复性浓度、复性率都得到很大的提高。同时，蛋白经过凝胶过滤层析本身也可得到一定的纯化。

两个重要的因素影响凝胶过滤层析复性蛋白的收率：第一个是变性条件下蛋白质的上样，第二个是复性缓冲液中蛋白质结构的变化。另外，蛋白质上样量也会影响蛋白质复性收率，因为在层析柱的顶端会因为上样量的增加而发生结构的聚集。

为了提高蛋白质复性效率，发展了一种梯度凝胶过滤层析复性方法。在色谱柱中预先设置变性剂浓度的梯度，当复性的蛋白质进入到柱子中后，由于蛋白质的表观分子量远远大于变性剂，从而蛋白质经过了一个变性剂浓度逐步降低的环境，蛋白质逐步地折叠复性，从而有效地降低了聚集体的形成，并能把聚集体和折叠的蛋白质进行分离。

线性梯度在凝胶过滤层析中可能经常会遇到，但是有时有些蛋白质可能在某些变性剂浓度下不稳定，在梯度过程中需要尽快跨越这些浓度过程；有时蛋白质折叠的限速在某些变性剂浓度下，此时需要增加此段的时间，所以在凝胶过滤层析中可以设计不同类型的梯度形式，以满足不同的蛋白质的复性需要。

分离纯化四大原理

1、反相高效液相色谱

反相高效液相色谱（RP-HPLC）是利用非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂或其水溶液作为流动相，根据溶质疏水性的差别进行分离纯化的洗脱色谱法。RP-HPLC主要用于分子量低于5000的多肽的分离纯化，因其具有分离效果好、分辨率高、重复性好、分析速度快等优点，在多肽的分离纯化和制备中得到广泛应用。目前 RP-HPLC分离柱是以硅胶基质的键合相填料为主体。尤其是键合 C18 ( Octadecylsilica,ODS )、C8 烷基以及苯基填料的出现，使该技术得到长足发展。这类填料的最大特点是颗粒刚性好，有利于传质，可以得到很高的柱效，并有良好的选择性。

2、离子交换色谱

离子交换色谱（IEXC）是以离子交换剂作为固定相，交换剂由固定离子基团及可交换的平衡离子组成。当流动相带着组分离子通过离子交换柱时，组分离子与可交换的离子进行可逆变换，最后达到交换平衡。离子交换色谱法的原理就是根据不同组分离子对固定离子基团的亲和力的差别而达到分离的目的。离子交换色谱又可分为阳离子交换色谱和阴离子交换色谱。相对的可选用的有阳离子交换填料和阴离子交换填料。IEXC最为明显的优势在于它的分离条件最接近生物的生理环境，对生物分子有一定的兼容性，以便于保存多肽的生物活性。对多肽分子进行分离纯化可采用两种方式，一是将目的产物离子化，被交换到介质上，杂质不被吸附，从柱流出，称为“正吸附”。此法优点是目的产物纯度高，且可达到浓缩目的，宜处理目的产物浓度低且工作液量大的溶液。另一方式是将杂质离子化后被交换，而目的产物不被交换直接流出，这种方式称为“负吸附”。采用此法通常可除去50%～ 70 %的杂质，适用于目的产物浓度高的工作液。以上两种方式的选择要依据样品及具体要求而定。无论是正吸附还是负吸附，离子交换色谱均已成为多肽化学中一重要的分离方法。

3、凝胶色谱

凝胶色谱（Gel FiltrationChromatography, GFC)是利用凝胶的网状结构，根据多肽分子的大小、形状差异进行分离的一种方法。如人重组生长激素 (hGH)的分离，不同结构、构型的GH在 GFC 柱上的分离行为完全不同，从而可分离不同构型或在氨基酸序列上有微小差异的变异体。一些分子量较大的肽或蛋白均可利用此法分离分析。凝胶色谱具有很多优点：介质为不带电荷的惰性物质，不与溶质分子作用，因此分离条件温和，产品收率高，生物活性好；工作范围广，分离分子量的覆盖面大，可分离从几百至数万分子量的分子。

4、亲和色谱

亲和色谱（AC）也称为亲和层析，是一种利用固定相与物质的特异性结合来实现分离和纯化目的的方法。

HPLC与其他分离纯化方法联用

肽的种类很多且大多具有相似性，使用单一的分离纯化手段已经不能达到理想的分离纯化效果。HPLC有可以进行大规模制备等优点，但存在费时、价高等缺点。HPLC与其他分离纯化方法技术的联用，集中了各种方法的优势，弥补了各技术的不足，在多肽分离纯化中已显示出巨大的优越性。

抓住了以上4点，也就掌握了多肽分离的核心！可以横扫一切多肽分离的问题啦！